第八章高效液相色谱法要点分析.pptVIP

1．HPLC与经典液相色谱法的比较 经典液相色谱的弱点： 柱效低、分离时间长、难以解决复杂问题 要提高柱效→减小固定相颗粒度，同时加快传质速率→研制粒度小、传质快的薄壳型填料 要缩短分离时间→加快流动相流速→高压泵 在线检测→吸收气相色谱类似的检测技术 原名：High Pressure Liquid Chromatograph（HPLC） 现名：High Performance Liquid Chromatograph（HPLC） 2．HPLC与GC的比较 （l）分析对象方面: GC主要分析气体和沸点较低的化合物； HPLC主要分离分析高沸点、热稳定性差、摩尔质量大的物质。 (2)流动相方面： GC采用惰性气体，仅起运载作用。 HPLC中流动相可选用不同极性的液体，流动相对分离起很大作用，相当于增加了一个控制和改进分离条件的参数，为选择最佳分离条件提供了极大方便。 (3)工作温度的要求： GC一般都在较高温度下进行的，而HPLC则经常可在室温条件下工作。 目前HPLC已被广泛应用于分析对生物学和医药上有重大意义的大分子物质，例如蛋白质、核酸、氨基酸、多糖类、植物色素、高聚物、染料及药物等物质的分离和分析。 3.高效液相色谱法的特点 HPLC仪可分为4个主要部分：高压输液系统，进样系统，分离系统和检测系统。此外还配有辅助装置：如梯度淋洗，自动进样及数据处理等。 一般由储液罐、高压输液泵、过滤器、压力脉动阻力器等组成，其中高压输液泵是核心部件。 高压输液泵性能要求： ① 流量稳定，精度达1%左右，保留时间与此有关 ② 耐高压，输出压力平稳，脉动小 ③ 流量范围宽，0.1～10ml/min ④ 具有梯度洗脱功能，操作方便 ⑤ 耐腐蚀，泵体易于清洁、维修、保养 2．进样系统 HPLC柱（约5～30cm）比GC柱短得多，所以柱外展宽（又称柱外效应）较突出。柱外展宽是指色谱柱外的因素所引起的峰展宽，主要包括进样系统、连接管道及检测器中存在死体积。柱外展宽可分柱前和柱后展宽。进样系统是引起柱前展宽的主要因素，因此HPLC中对进样技术要求较严格。 要求：密封性、重复性、死体积小、便于自动化 ① 六通阀进样装置：耐磨、密封性好、耐高压、死体积小。 ② 自动进样装置 取样、进样、复位、管路清洗、样品盘旋转均自动，进样重复性高，适用于大量样品分析。有圆盘式和链式自动进样器。 3. 分离系统——色谱柱 色谱柱包括柱管与固定相两部分。柱体为直型不锈钢管，内径1～6 mm，柱长5～40 cm。发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效。 2mm，细管径柱 2～5mm，常规柱，用于一般分析 5mm，半制备柱或制备柱 色谱柱使用过程中应注意： （1）不碰撞、弯曲或强烈振动 （2）连接时，勿用力过猛，以不漏为准 （3）样品最好用膜过滤，或萃取、吸附分离大含量杂质 （4）更换流动相时，应选择合适的溶剂冲洗色谱柱，以免流动相相互不溶或盐析出而堵塞柱子 （5）当出现异常的高柱压时，应用适当的溶剂冲洗柱子 （6）实验结束，应用适当溶剂冲洗 （7）柱子存放在密封的容器中 （8）适当时对柱子进行再生： 键合相C18柱：用蒸馏水冲洗，冲洗过程中分四次用少量二甲亚砜冲洗，再用等体积甲醇、氯仿、甲醇冲洗。 硅胶柱：用二氯甲烷、甲醇、水、甲醇、干燥的二氯甲烷、己烷冲洗。 前置柱:柱内填充物和分离柱完全一样，使淋洗溶剂由于经过前置柱为其中的固定相饱和，使它在流过分离柱时不再洗脱其中固定相，保证分离技的性能不受影响。 4．检测系统 溶质型检测器 仅对被分离组分的物理或化学特性有响应，如紫外、荧光、电化学检测器等。 总体检测器 它对试样和洗脱液总的物理或化学性质有响应，如示差折光，电导检测器等。 （1）紫外检测器 组成：光源、分光系统、流通池和检测系统。 对大部分有机化合物有响应，应用广。 要求：被测组分有紫外吸收，而流动相无紫外吸收或与被测组分紫外吸收波长不同。 （2）光电二极管阵列检测器 光电二极管阵列检测器 普通紫外检测器和光电二极管阵列检测器的比较 （4）示差折光检测器 （5） 蒸发光散射检测器 （5） 其他类型检测器 8.3 HPLC的固定相和流动相 以承受高压能力来分类：刚性固体和硬胶 刚性固体以二氧化硅为基质，可承受7.O×108～1.O×109Pa的高压，可制成直径、形状、孔隙度不同的颗粒。 硬胶由聚苯乙烯与二乙烯苯基