高效液相色谱培训(HPLC使用与维护)要点分析.pptxVIP

HPLC的使用与维护基本原理和特点液相色谱仪器部件实验操作与应用日常维护基本原理和特点基本原理：溶于流动相(mobilephase)中的各组分经过固定相时,由于与固定相(stationaryphase)发生作用(吸附,分配,离子吸引,排阻,亲和)的大小,强弱不同,在固定相中滞留时间不同,从而先后从固定相中流出.特点：分离效率高、分析速度快、应用范围广、操作自动化。一些商品化仪器脱气装置四元泵检测器柱温箱样品盘控温箱流动相启动液相色谱仪器的流程开启HPLC系统各个设备的电源打开泵、自动进样器、检测器电源，待设备通过自检后，打开计算机启动色谱管理软件准备流动相过滤，脱气色谱泵排气用新配制的流动相灌注泵高效液相色谱仪组成输液系统进样系统分离系统检测系统数据记录处理系统液相色谱流程图液相色谱的流动相液相柱---保留值与pH的关系pH变化值0.1RS变化值1.6色谱柱：ZorbaxStableBondC184.6*250mm,5um流动相：27%甲醇：73%磷酸pH：2.52.6温度：50℃流速：1.0mL/min.2.流动相类别按流动相组成分：单组分和多组分按极性分：极性、弱极性、非极性按使用方式分：等度洗脱和梯度洗脱对溶剂的要求水：去离子水自动纯水仪　　　纯净水　　商品瓶装水溶剂:色谱纯（甲醇，乙腈，乙醇，丙酮，异丙醇）　试剂:分析纯不管采用何种途径，配制流动相应用新鲜水，水质要求越高放置时间越短。理想的HPLC用水应为18.2Ω的超纯水，并通过0.22um的滤膜，除去热源、有机物、无机离子及空气等。过滤：0.45um或更小孔径滤膜目的：除去溶剂中的微小颗粒，避免堵塞色谱柱，尤其是使用无机盐配制的缓冲液。脱气：除去流动相中溶解或因混合而产生的气泡气泡对测定的影响：1）泵中气泡使液流波动，改变保留时间和峰面积2）柱中气泡使流动相绕流，峰变形3）检测器中的气泡产生基线波动过滤与脱气流动相的保存有机溶剂流动相：室温下密封，避光保存缓冲盐流动相：当日现配现用：低温下密封保存，一般不超过3天防止微生物生长有机溶剂与水（缓冲盐）混配的流动相：低温密封保存防止有机相的挥发选用适宜的容器1．梯度洗脱的特点（1）改善分离,加快分析速度；（2）改善峰形,减少拖尾,有利于痕量组分的检测；（3）增加峰容量；（4）强烈滞留的组分不容易残留在柱上,保持柱性能长期良好；（5）下次分析时,流动相需要一段平衡时间；不同溶剂的UV吸收程度稍有差异,可能会引起基线漂移2．梯度洗脱的主要条件①A流动相/弱溶剂组成；②B流动相/强溶剂组成；③梯度时间；④梯度曲线：线性、凸型或凹型等。梯度洗脱梯度：低压混合低压梯度用单泵产生梯度，泵前（低压端）混合对脱气要求高不易调节梯度的滞后体积如设计不当，梯度的准确性受影响滞后体积（系统体积）设计合理梯度滞后：系统体积的影响注意∶滞后体积包括进样器、阻尼器、混合器及其管路梯度滞后大小的影响滞后体积太大会引起梯度变化的延迟例如：滞后体积为2.0ml，流速1.0ml/min实际梯度会比设置值晚2分钟响应，没有问题对微柱色谱影响更大，同上例但流速0.1ml/min实际梯度会比设置值晚20分钟响应，不能接受滞后体积的不同会使方法转换麻烦滞后体积比文献大或小都会使方法不能重现滞后体积的变化会导致梯度重现性不好普通分析型液相色谱的滞后体积为2~4ml滞后体积变化的影响设计不好的HPLC系统，滞后体积随反压变化滞后体积随反压变化的后果：梯度的准确性不好，造成：方法的适应性不好用静态梯度混合器；固定滞后体积可明显改善梯度特性液相色谱的色谱柱色谱柱的连接Stop_depth长度不合适造成柱前死体积锥箍锥度不合适造成渗漏色谱柱的连接除去柱上端固定相变色部分(约3mm左右)，再补充新的固定相。色谱柱吸附未被洗脱成分时，柱效将明显下降，选合适的溶剂进行洗净。采用梯度洗脱时，柱在重复使用前，用泵把几倍于柱体积的起始溶剂压经柱子，以重新建立起始的平衡来得到再生。可能提高柱效的方法HPLC检测器应提供的功能对样品有响应并有一个输出信号应该提供在检测器响应值与样品浓度之间的线性关系；并且所设计的校正技术应该促进这种关系理想的HPLC检测器高灵敏度；可忽略的基线噪音宽的线性范围独立于流动相及操作参数的响应对压力、温度及流速等变化不敏感长时间操作的稳定性低死体积非破坏性选择性灵敏度：信噪比灵敏度是信号与噪音的比值；即峰高与基线噪音的比值（S/N）检测限（LOD）：S/N=2~4定量限（LOQ）：S/N=8~10好的信噪比有利于：更好的色谱峰确认更好的定量更好地完成色谱峰纯度/均一性 6:1NS吸光度（AbsorbanceUV/Vis）检测目前实验室中最流行的选择多数公司约75%的检测器是吸光度检测器（其中50%是多波长，25%是PDA）测量通过溶液后的紫外或可见光光强