丝氨酸羟甲基转移酶的电泳制备.分析报告.ppt

项目三、丝氨酸羟甲基转移酶的电泳制备 任务1 SHMT电泳制备方案的制定及实训准备 指导老师：彭加平、韦平和 班级：生物制药1213 制作人：孙玉桃 学号：2012040722 实训原理 3.SDS电泳，是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS （十二烷基硫酸钠），SDS能断裂分子内和分子间氢键，破 坏蛋白质的二级和三级结构，强还原剂能使半胱氨酸之间的 二硫键断裂，蛋白质在一定浓度的含有强还原剂的SDS溶液 中，与SDS分子按比例结合，形成带负电荷的SDS-蛋白质 丧失了原有的电荷状态形成仅保持原有分子大小为特性的负 离子团块，从而降低或消除了各种蛋白质分子之间天然的电 荷差异，由于SDS与蛋白质的结合是按重量成比例的，因此 在进行电泳时，蛋白质分子的速率取决于分子大小。 （1）分离胶制备：按表配制20mL 10%分离胶，混匀后用细长 头滴管将凝胶液加至长、短 玻璃板间的缝隙内，约8cm 高，用1mL注射器取少许蒸 馏水，沿长玻璃板板壁缓慢 注入，约3-4mm高，以进行 水封。约30min后，凝胶与 水封层间折射率不同的界线， 则表示凝胶完全聚合。倾去 水封层的蒸馏水，再用滤纸 条吸去多余水分。 浓缩胶的制备：按表配制10mL 3%浓缩胶，混匀后用细长头滴管 将浓缩胶加到已聚合的分离胶上方， 直至距离短玻璃板上缘约0.5cm处， 轻轻将样品槽模板插入浓缩胶内， 避免带入气泡。约30min后凝胶聚 合，再放置20-30min。待凝胶凝固 ，小心拔去样品槽模板，用窄条滤 纸吸去样品凹槽中多余的水分，将 pH8.3Tris-甘氨酸缓冲液倒入上、 下贮槽中，应没过短板约0.5cm以 上，即可准备加样。 注意事项 1.安装电泳槽时注意均匀用力旋紧固定螺丝，避免缓冲液渗漏。 2.用琼脂糖底部及灌胶时不能有气泡，以免电泳时影响电流的通过。 3.样品中应含有一定浓度的蔗糖溶液，目的是用以防止样品因对流而被 稀释。 4.加样时样品不能超出凹形样品槽。加样槽中不能有气泡，若有气泡， 可用注射器针头挑除。 5.电泳槽内加入电泳缓冲液冲洗清除粘附在凝胶底部的气和未聚合的丙 烯酰胺，同时建议低电压短时间的预电泳，清除凝胶内的杂质，疏通凝 胶孔径以保证电泳过程中的电泳的畅通（恒压10-20V，20-30min）。 6.加样前样品应先离心，尤其是长时间放置的样品，以减少蛋白质带的 拖尾现象。 7.为避免边缘效应，可在未加样的孔中加入等量的样品缓冲液。 目录 2.聚丙烯酰胺凝胶电泳简介 4.实训原料、仪器和试剂 1.实训基础知识 3.实训原理 5.实训步骤 6.注意事项 实训基础知识 丝氨酸羟甲基转移酶（SHMT）在自然界中普遍存在，它的生理学功能是催化丝氨酸和甘氨酸之间可逆的互换。 SHMT的催化反应是氨基酸和核酸代谢的连接点，在氨基酸的工业生产和植物的光呼吸过程中，SHMT也是一个关键酶。L-丝氨酸在体内代谢速度极快，因此，直接发酵生产很困难。 酶法合成L-丝氨酸由于利用甘氨酸和甲醛特异的合成L-丝氨酸，具有原料来源方便，原料成本低和可合成高浓度产品等优点，因此是最有前景的L-丝氨酸生产方法。 实训基础知识 电泳是指带点颗粒在电场中将受到电场力的作用而发生泳动。 这种特性，用电泳的方法对这些物质进行定性及定量分许，也可用于混合物的分离。 凝胶电泳用于其操作简单、快捷、灵敏等优点，已成为蛋白质、核算研究的首选标准方法。 电泳技术的分类 粉末电泳，如纤维素粉、淀粉、玻璃粉电泳 丝线电泳，如尼龙丝、人造丝电泳 凝胶电泳，如琼脂糖、淀粉胶、聚丙烯酰胺凝胶电泳 滤纸及其他纤维素膜电泳 按支持物物理性状分类 电泳技术的分类 垂直板式电泳 连续式流动电泳 平板式电泳 按支持物的装置 形式不同分类 电泳技术的分类 不连续pH电泳 连续pH电泳：电泳全部过程中缓冲液 pH保持不变滤纸及其他纤维素膜电泳 按pH的连续 性不同分类 凝胶电泳技术 几乎所有蛋白质电泳分析都在聚丙烯酰胺凝胶上进行，所有条件总要确保蛋白质解离成单个多肽亚基并尽可能减少其相互间的聚焦，最常用的就SDS电泳技术。 SDS电泳可用圆盘和垂直平板电泳的形式，原理相同，步骤也大致相同。SDS电泳可分为不连续系统和连续系统。 本实验采用垂直平板以不连续系统的SDS方