纸层析法—氨基酸的分离与鉴定重点解读.docxVIP

纸层析法——氨基酸的分离与鉴定 实验目的 了解纸层析法的使用原理。 2、掌握用纸层析法分离蛋白质的操作步骤。 实验原理 纸层析法是以滤纸作为惰性支持物的分配层析方法，滤纸上的纤维具有羟基，是亲水基团，滤纸吸附水作为固定相，其上流经的有机溶剂即展层剂作为流动相。当展层剂流经固定相时，固定相上的样品由于亲水、疏水能力不同，在两相之间不断分配，疏水能力强的多溶于流动相，随流动相移动距离较远，亲水能力强的移动距离则较近。 所有的氨基酸的α碳上均连接一个氢原子和两个亲水基团羧基（—COOH）与氨基（—NH2），唯一的不同则在于R基团。因此R基团在氨基酸的亲水疏水能力对比中起到了决定性的作用。本实验采用丙氨酸，苯丙氨酸，天冬氨酸，其R基团分别是—CH3，—CH2—C6H5，—CH2—COOH，其亲水疏水能力迥异，能在滤纸上明显分开。 Rf值表示原点中心至显色斑点中心的距离与原点中心至流动相前沿的距离比。在一定条件下，Rf值为定值，其影响的因素有物质本身的性质，溶剂的性质，PH值，温度，滤纸的性质等等，本实验不予探究。在测量原点中心至显色斑点中心的距离时，由于斑点的形状不规范（近似圆形），所以，一般取斑点的重心，测量出重心与起点的距离即可。 显色原理：茚三酮在弱碱性溶液中与α—氨基酸共热，引起氨基酸氧化脱氧，脱羧反应，最后茚三酮与反应产物——氨和还原茚三酮发生作用生成紫色物质。 试剂 （一）提前配制试剂 8*10-3mol/L丙氨酸溶液：精确称取0.356g晶体，溶解后定容到500ml。 8*10-3mol/L苯丙氨酸溶液：精确称取0.661g晶体，溶解后定容到500ml。 8*10-3mol/L天冬氨酸溶液：精确称取0.532g晶体，溶解后定容到500ml。（将上述三种溶液装于小瓶中实验时，每两组共用一组试剂） 正丁醇 88%甲酸 蒸馏水 茚三酮晶体 注：实验时，以上试剂均为每两组同学共用一组试剂。 （二）当堂配制试剂 丙氨酸，苯丙氨酸，天冬氨酸的混合液:将上述溶液等体积混合即可 实验仪器 每组： 钟罩：1 试管：15mm*10cm *5 试管架：1 培养皿：95mm*1 移液管：10ml *1 洗耳球：1 小烧杯：25ml *2 （可以用其他小规格的烧杯如20,10,8ml的代替）100ml*1 滤纸：15cm*15cm *1 铅笔 ：1 直尺：1 毛细吸管：4 保鲜膜：1 细玻璃棒：1 公用： 电吹风：3 酒精灯：3 订书机：3 电子天平或分析天平：3 称量纸：若干 烘箱：1 量筒：100ml*1 薄膜手套：若干 操作步骤 （一）展层剂和平衡溶剂的配制 1．在100ml烧杯中按照体积比 正丁醇：88%甲酸：蒸馏水=15：3：2的比例配制展层剂，建议为45ml：9ml：6ml。 2．称取0.05g茚三酮晶体，并用玻璃棒搅拌溶于展层剂中，盖上培养皿。 3．平衡溶剂与展层剂相同。 （二）点样 1．实验台上铺好保鲜膜，保鲜膜下面可以蘸少量水，使得保鲜膜能与实验台面紧密贴合，此后所有操作都在保鲜膜上进行，不再赘述。 2．在距平行于15cm长的边2cm处用铅笔轻轻描出一条直线，此为展层起点线，在直线中间每隔3cm用铅笔轻轻点一个点，共点四个点。再在另一边，距边缘1cm处用铅笔轻描出一条直线，此为展层终点线。 3．将毛细管的一端在酒精灯外焰上灼烧3~6s，毛细管管口变细即可。 4．用毛细管分别蘸取三个氨基酸标准液和氨基酸混合液，点样于展层起点线的四个点上。点完一次后，用电吹风冷风吹干，再点第二次样。每次点样均要求斑点半径 。 5．在标准样下面用铅笔做好标记，记录该点的氨基酸名称。 （三）平衡及展层 1．将点好样的滤纸两侧边缘对齐但不接触，卷成筒形，并用订书机订3~4次，将圆筒固定。 2．将圆筒竖直放入培养皿中，滤纸勿与皿壁接触，皿周围放2个25ml小烧杯，内盛平衡溶液10ml左右，盖上钟罩，平衡半个小时。 3．用移液管吸取10ml展层剂，打开钟罩