重组质粒的构建、转化和重组子的筛选与鉴定重点解读.docxVIP

重组质粒的构建、转化和重组子的筛选与鉴定 姓名:郑小煜 学号:201100140069 班级:11级生技班 同组者:赵莉、高瑞 【实验目的】 学习在实现DNA的体外重组过程中，正确选择合适的载体和限制性内切酶，并利用限制性核酸内切酶对载体和目的DNA进行切割，产生利于连接的合适末端。 通过对DNA的酶切，学习设计构建重组DNA分子的基本方法，掌握载体和外源目的DNA酶切的操作技术。 学习利用T4 DNA连接酶把酶切后的载体片段和外源目的DNA片段连接起来，构建体外重组DNA 分子的技术，了解并掌握几种常用的连接方法。 掌握利用CaCl2 制备感受态细胞的方法。 学习并掌握热击法转化E.coli的原理和方法。 在使用红白菌落法筛选获得重组子的基础上，本实验学习通过对重组子进行重组质粒DNA的抽提鉴定，以进一步确定重组质粒中含有外源目的DNA片段，验证重组子是期望的重组子的方法。 通过学习掌握重组DNA分子鉴定的基本方法。 掌握α互补筛选法筛选重组子的方法。并鉴定体外导入目的DNA片段的大小。 学习用试剂盒提取重组质粒DNA的方法。 复习琼脂糖凝胶电泳的原理及方法。 【实验原理】 外源DNA与载体分子的连接即为DNA重组技术，这样重新组合的DNA分子叫做重组子。重组的DNA分子在DNA连接酶的作用下，有Mg2+、ATP存在的连接缓冲系统中，将分别经限制性内切酶酶切的载体分子和外源DNA分子连接起来。将重组质粒导入感受态细胞中，将转化后的细胞在选择性培养基中培养，可以通过α互补筛选法筛选出重组子，并可通过酶切电泳及PCR检验的方法进行重组子的鉴定。 限制性核酸内切酶及酶切反应 体外构建重组DNA分子，首先，要了解目的基因的酶切图谱，选用的限制性内切酶不能目的基因内部有专一的识别位点，即当用一种或两种限制性核酸内切酶切割外源供体DNA时，能得到完整的目的基因。其次，要选择具有相应的单一酶切位点的质粒或者噬菌体等载体分子作为克隆的载体。常用的酶切方法有双酶切法和单酶切法两种。 本实验采用单酶切法，即只能用一种限制性核酸内切酶切割目的DNA片段，酶切后的片段两端将产生相同的黏性末端或平末端。选择具有相同限制性核酸内切酶识别位点的合适载体，在构建重组分子时，除了形成正常的重组子外，还可能出现目的DNA片段以相反方向插入载体分子中，或目的DNA串联后再插入载体分子中，甚至出现载体分子自连，重新环化的现象，因此重组效率较低。 单酶切法简单易行，但后期筛选工作比较复杂。各种限制性核酸内切酶都有其最佳反应条件，其中最主要的因素是反应温度和缓冲液的组成，为了实验中的方便，根据离子强度可将各种酶的缓冲液分为三类：高盐、中盐和低盐离子强度缓冲液。在双酶切体系中，限制性内切酶在使用时应遵循“先低盐后高盐，先低温后高温”的原则进行反应。 酶切与连接是两个密切相关的步骤，要达到高效率的连接，必须酶切完全，酶切的DNA数量要适当。另外，酶切反应的规模也取决于需要酶切的DNA的量，以及相应的酶量。一般的，酶切0.2~1.0μg的DNA分子时，反应体积约为15~20μL，DNA的量增大，反应体积可按比例适当放大。酶的用量参照标准：一个标准单位（U）酶能在指定的缓冲液系统和温度下，1h完全酶解1μg pBR322 DNA。如果酶活力低，可以适当增加酶的用量，但是最高不能超过反应总体积的10%，因为限制性核酸内切酶一般是保存在50%甘油的缓冲液中，如果酶切反应体系中甘油的含量超过5%，就会抑制酶的活性。 2、载体与外源DNA的连接反应 在基因工程操作中,连接反应总是紧跟酶切反应，外源DNA片段与载体分子连接的方法即DNA分子体外重组技术主要依赖于限制性核算内切酶和DNA连接酶催化完成的。DNA连接酶催化两双链DNA片段相邻的5’-磷酸和3’-OH间形成磷酸二酯键。在分子克隆中最有用的DNA连接酶是来自T4噬菌体的T4 DNA连接酶，该酶需要ATP作为辅助因子。它可以连接黏性末端和平末端。连接反应时，载体DNA和外源DNA的摩尔数之比控制在1:（1~3）之间，可以有效地解决DNA多拷贝插入的现象。反应温度介于酶作用速率和末端结合速率之间，一般是16℃，用常用的连接时间为12-16h。 本实验的连接反应方式是互补粘性末端DNA片段之间的连接： 当载体和外源DNA用同一种限制性核酸内切酶切割时，产生相同的黏性末端，连接后形成的重组DNA分子仍保留原限制性核酸内切酶的识别序列。若外源DNA插入片段和适当的载体存在同源黏性末端，这将是最方便的克隆途径。但是，在同黏性末端连接方案中，存在高背景和两向插入的弊端。 如果用两种能够产生相同的黏性末端的限制性核酸内切酶（同尾酶）切割时，虽然也可以有效地进行连接，但是获得的重组DNA分子一般是消失了原来用于切