紫锥菊中菊苣酸提取纯化工艺研究重点解读.docxVIP

紫锥菊提取物中菊苣酸的提取纯化研究 菊苣酸是紫锥菊提取物中极为重要的免疫活性成分之一，具有增强人体免疫力和抗炎作用。现有的高纯度菊苣酸制备工艺对生产设备要求高、不易放大，且目前只能生产对照品，这在很大程度上限制了紫锥菊提取菊苣酸生产的高效率、低成本化发展。因此，西安源森生物实验室将紫锥菊中提取纯化菊苣酸成分的工艺作为本次实验主题进行研究： 一、源森生物紫锥菊提取菊苣酸准备仪器与材料 高效液相色谱仪； L—7420紫外检测器； RE—52A旋转蒸发器； DZ—2BC型真空干燥箱； 紫锥菊根→自然干燥→粉碎； 菊苣酸对照品； 纯度94%;AB-8树脂。 二、源森生物紫锥菊提取纯化菊苣酸的方法与结果 （一）HPLC法测定紫锥菊提取物中菊苣酸的含量 1. 色谱条件： 色谱柱:A lltima C18(250 mm×4. 6mm, 5μm)； 流动相:乙腈-1. 8%冰醋酸(25∶75)； 体积流量: 1. 0mL /m in； 检测波长: 327 nm； 柱温: 35℃； 进样量: 5μL。 2. 标准曲线的制备： 精密称取菊苣酸对照品5. 05mg→置10mL量瓶中→用70%乙醇溶解并加至刻度→精密吸取对照品溶液0. 5、1. 0、2. 0、3. 0、4. 0、5. 0、6. 0μL注入液相色谱仪中→测定峰面积。 以菊苣酸质量X为横坐标，峰面积Y为纵坐标，得方程:Y= 401 209X+ 23 809，r= 0. 999 5，线性范围:0. 25～3. 03μg。 3. 供试品溶液的制备： 精密称取各提取物、纯化物、萃取物样品适量→置10mL量瓶中→用70%乙醇溶解→超声提取10 m in→加70%乙醇至刻度→过0. 45μm滤膜，即得。 4. 测定： 采用外标法进行测定。 （二）紫锥菊植物中提取菊苣酸 1. 提取溶剂的选择： 从紫锥菊植物中提取菊苣酸一般采取乙醇、甲醇或它们的水溶液。考虑到试剂价格和工业化生产的可行性，西安源森生物本实验选择乙醇作为提取溶剂。 分别称取20g紫锥菊根7份，以10倍质量的0、20%、40%、55%、70%、85%、100%乙醇水溶液在80℃加热回流提取2h→所得滤液蒸干→得紫锥菊提取物，采用HPLC测定紫锥菊提取物中菊苣酸的含量，并计算菊苣酸的得率。结果见图1： 由以上图1可以看出，随着乙醇体积分数的增加，紫锥菊提取物汇总菊苣酸的得率逐渐升高，当乙醇溶液的体积分数为40%时，菊苣酸的得率达最大。随后，紫锥菊提取菊苣酸的得率随乙醇体积分数的增加而降低。 这是因为紫锥菊根中含有多酚氧化酶，乙醇能使多酚氧化酶失活，当直接用水提取时，菊苣酸在几分钟之内迅速被氧化，所以用水提菊苣酸得率较低； 而乙醇体积分数的增加可阻止紫锥菊提取物中菊苣酸被氧化，但乙醇的体积分数过高时，紫锥菊药材组织内的菊苣酸在乙醇溶液中的溶解度降低，导致菊苣酸不能被提取出来。 2. 菊苣酸提取条件的优化： 在预试验的基础上，选择提取温度(A)、溶剂用量(B)、提取时间(C)、提取次数(D)为因素，各取3个水平，以菊苣酸得率为指标，采用L9(34)正交试验优选，结果见表1、2： 由此可见，紫锥菊提取菊苣酸的最佳组合条件为A3B3C2D3：即温度为90℃、溶剂用量为15倍、提取3次、每次2 h。 按照正交试验得到的最优提取条件，进行3次重复试验，紫锥菊提取物中菊苣酸的质量分数为4. 1%，菊苣酸提取得率为1. 12%。 （三）紫锥菊提取物的树脂法纯化： 紫锥菊提取液浓缩至原来的1/10→回收乙醇→作为大孔吸附树脂的工作液。通过对AB-8、S-8、H103、NKA-9、X-5、D4020、D3520、NKA-2、D4006大孔吸附树脂进行静态吸附试验，发现AB-8树脂对菊苣酸的饱和吸附容量最高，达56.36mg/g湿树脂。 在解吸试验中，AB-8树脂吸附饱和后，依次用水及10%、30%、50%、70%、90%乙醇溶液进行洗脱，收集各部分洗脱液。HPLC分析结果表明，水及10%乙醇洗脱液中没有菊苣酸洗脱下来， 30%、50%乙醇洗脱液中含有菊苣酸，而70%、90%乙醇溶液中不含菊苣酸。 故树脂吸附饱和后，先用水洗脱至无色，再用50%乙醇洗脱，即可得菊苣酸粗品。 　在静态吸附研究的基础上，上AB-8树脂玻璃柱(自制，15 cm×2 cm，树脂床体积为30mL)进行动态穿透试验。上柱液中菊苣酸质量浓度为3. 30mg /mL，以2BV/h连续上柱，自动部分收集流出液，采用HPLC法测定菊苣酸含量，得到AB-8树脂泄漏曲线，见图2： 可见30mL AB-8树脂可处理6BV(180mL)的物料液量而基本不发生泄漏。此时树脂床共吸附菊苣酸594mg (6×30×3. 30)，湿态AB-8树脂对菊苣酸的工作吸附量(泄漏前吸附量)可达19. 8mg /mL，达到