重组子的筛选与鉴定解析.pptxVIP

NJU 重组子的筛选（screening）与鉴定;第一节、有关概念;转化子与非转化子;重组子：含有重组DNA分子的转化子。 非重组子：仅含有空载体分子的转化子。;期望重组子与非期望重组子;转化子、重组子、期望重组子关系 ;筛选（screening）;鉴定;选择标记基因（selectable marker gene）;报告基因（reporter gene）;第二节、大肠杆菌重组体的筛选;一、质粒载体转化大肠杆菌细胞的筛选;插入失活筛选法的应用;带双抗生素抗性标记的质粒载体转化大肠杆菌的筛选方法;例;空载体转化菌落及 重组载体转化菌落;筛选具体做法;影印平板培养法;利用lacZ′基因的插入失活筛选重组子—蓝白筛选法 ;蓝白筛选菌落生长照片;X-gal;IPTG及其作用;大肠杆菌乳糖操纵子基因组成;例1:pUC8中lacZ′基因的插入失活;例二：pGEM-3Z中lacZ′基因的插入失活;（二）插入表达筛选;二、 重组噬菌体DNA转入大肠杆菌后重组???的筛选;（二）插入型载体;选择标记基因;1、利用lacZ′基因的插入失活筛选重组噬菌斑 ;2、λ噬菌体的cI基因的插入失活筛选——cI筛选法 ;Polylinker插入不影响lacZ′基因表达;噬菌斑;2、 cI基因插入失活筛选; ;3、spi-筛选;三、杂交筛选;第三节、转化/重组酵母菌的筛选;一、利用营养缺陷互补基因的筛选方法;酵母常用营养标记基因;例：含HIS的载体;组氨醇脱氢酶基因（histidinol dehydrogenase gene，his4）缺失的毕赤酵母;含URA3的载体及其相应的受体细胞;二、酵母常用显性标记基因;（一）Neo选择系统;（二）Zeo选择系统;;三、酵母其他显性标记基因;利用赭石突变抑制基因 sup4筛选重组酵母菌;;第四节、转染的哺乳动物细胞筛选;一、哺乳动物细胞常用的选择标记基因;黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（XGPRT）基因（ecogpt）选择系统 ;合成GMP 的不同途径;HGPRT基因选择系统组成;胸苷合成中的主要抑制剂;二、哺乳动物细胞常用报告基因;三、哺乳动物细胞其他选择标记基因;二氢叶酸还原酶基因（dfhr）选择系统;二氢叶酸还原酶基因（dfhr）选择系统组成 ;胸腺嘧啶脱氧核苷激酶基因（tk）选择系统;HAT选择培养基;筛选TK 活性缺陷细胞的HAT培养基主要组成;合成dTTP的不同途径;第五节、重组子结构特征的鉴定 ;一、 核酸分子杂交筛选法 ; ;二、裂解细菌电泳鉴定分子大小法筛选重组子;裂解细菌电泳鉴定分子大小法筛选重组子的步骤 ;三、限制性内切酶法;四、PCR法;PCR引物设计示意图 ; 例、酵母重组子的筛选和酵母重组子聚合酶链反应检测;五、蛋白表达检测法;（一）SDS;（二） Western Blot（ Western印迹法）;免疫印迹法操作步骤; ;（三）ELISA（酶联免疫吸附试验）检测表达蛋白; ; ;ELISA法特点及应用;六、 插入片断序列分析