AQP1前列腺癌7.docVIP

缺氧诱导上调水通道蛋白蛋白质在前列腺癌细胞p38依赖性 等张和血清低氧模型被用来调查AQP1表达式P38MAPK的特殊抑制剂可以被AQP1表达所引导的集中缺氧区域所影响。细胞外的钙离子和PKC被显示受p18MAPK通路活化的影响。而且，AQP1在等密度培养基中取决于低的氧浓度。在较高的细胞培养基中，一定浓度的分泌蛋白质可以直接诱导AQP1蛋白的表达。 结论：这些发现说明水通道蛋白1可以在转录水平被缺氧所引起，并且在PC-3M细胞中AQP1的调整取决于钙离子、PKC和p38MAPK，以及较低的氧浓度。 简介： 水通道蛋白是细胞膜通道糖蛋白家族的一部分，一开始被证明通过一个细胞内外的渗透梯度介导的细胞膜转运蛋白。家族第一成员AQP1在许多细胞类型中例如上皮细胞、内皮细胞以及大脑外的微脉管内皮细胞以及大量的肿瘤细胞被呈现。最近显示，大量的研究集中在肿瘤细胞在调整水通道蛋白1表达上面和它对肿瘤基因的影响上面，肿瘤生长和进展方面。根据临床研究，AQP1表达在肾细胞癌患者中被当做了一项新的肿瘤分子标记物。在完全没有AQP-1的大鼠体内，我们发现了受损的肿瘤生长、减低的肿瘤生长速度以及大量的肿瘤坏死。我们之前的研究已经说明一种碳脱甘酶抑制剂乙酰唑胺可以抑制AQP1蛋白表达和肿瘤组织的血管再生。而且，在肿瘤区域内AQP-1过量的表达机制并没有被证明。 相比较正常组织，肿瘤组织是含氧量十分低的和大量的缺氧组织。进展性肿瘤经常具有不充足的血液供应，一部分原因是肿瘤细胞的生长速度明显快于内皮细胞，另一部分是因为新形成的血管供应是紊乱的。因此，缺氧经常包含了较快生长速度的进展性肿瘤。当肿瘤被暴露在缺氧环境中，转录因子HIF-1被活化，而且通过联合特定的区域授予缺氧条件从而促进许多基因的转录。而且那是重要的，HIF-1并没有参加单独的信号通路，这些基因负责调整肿瘤对缺盐环境的适应，以及调整下游包含蛋白的表达。其他信号通路童颜被缺氧所活化，他们可以潜在的调整AQP1蛋白的表达。分裂素活化的蛋白激酶负责诱导一些AQP蛋白系列的引导，并且MAPKs可以被缺氧所活化。本研究的目的是检测这个假设，即缺氧可以在肿瘤细胞中通过活化MAPKs调整AQP1蛋白的表达。 因此，目前的研究中我们证明了缺氧机制可以通过促进人前列腺癌PC-3M细胞诱导AQP1蛋白的表达。细胞内缺氧模型可以被培养密度所诱导，就像使用较多的二氯化钴模仿的一样。总之，我们使用透析膜平和培养集中的密度改变，例如渗透压，它可以影响AQP1的表达。 材料和方法： 材料：脂质体2000购于Invitrogen公司，p蓝图质粒表达鼠受赠于Fischbarg公司，抗AQP1抗体受赠于DR.B.Yang，抗p38MAPK抗体和抗p-p38MAPK抗体购于Santa Cruz。异硫氰酸荧光素硫氰基)共轭山羊免疫球蛋白G(免疫球蛋白G)和异硫氰酸酯(TRITC)共轭山羊免疫球蛋白g是从Becton Dickinson。pGL3-Basic向量和pRL-TK质粒从Promega购买快生物诱变TransGen Biotech处购买Dual-luciferase受体分析系统从Promega购买。RPMI 1640CoCl2以及碘化丙啶从Sigma-Aldrich公司处购买。其他试剂从Chinese Chemical 公司购买。 质粒构建： AQP1质粒像之前描述的那样构建。简洁地说，pBluescript表达质粒包含老鼠AQP1的互补与EcoRI / ApaI消化然后subcloned到pEGFP-C3提取AQP1的互补向量在EcoRI ApaIpEGFP/AQP1。插入了消化的正确性EcoRI / ApaI和DNA测序abi - 373 a自动化DNA细胞被镀在浓度1×106细胞在100毫米的盘子里和34.8毫米板无血清培养基是透析对血清RPMI 1640在等压的条件下介质,确保细胞培养非特异性的结合位点的细胞被封锁5%正常山羊一夜之间血清30分钟和孵化与反在4°CAQP1抗体(1/500),anti-p38 MAPK抗体(1/500)anti-p-p38 MAPK抗体(1/500)。荧光信号发出FITC-conjugated二级抗体徕卡TCS SP2共焦显微镜观察。由流式细胞分析仪量化AQP1的表达、MAPK和p-p38 MAPK后根据需要接受治疗细胞洗冷PBS(3×10分钟)和离心机在800 rpm为5分钟4°C。在那之后,细胞用4%多聚甲醛固定PBS在室温下15分钟,然后permeabilized0.1% Triton x - 100在室温下5分钟。在那之后,细胞用4%多聚甲醛固定PBS在室温下15分钟,然后permeabilized0.1% Triton x - 100在室温下5分钟。然后用anti-AQP1孵化