松阿扁叶蜂SSR.docVIP

松阿扁叶蜂SSR 摘要：以ｓｄｓ－蛋白酶ｋ法提取的松阿扁叶蜂（ａｃａｎｔｈｏｌｙｄａ ｐｏｓｔｉｃａｌｉｓ ｍａｔｓｕｍｕｒａ）基因组ｄｎａ为模板，利用ｌ１６（４５）正交设计对影响松阿扁叶蜂ｓｓｒ－ｐｃｒ反应的主要参数ｄｎａ模板、ｔａｑ ｄｎａ聚合酶、ｍｇ２＋、引物和ｄｎｔｐｓ进行优化。结果表明，松阿扁叶蜂ｓｓｒ－ｐｃｒ最优的反应体系为２５ μｌ体系中含１.00 ｕ ｔａｑ ｄｎａ聚合酶、３．００ ｍｍｏｌ／ｌ ｍｇ２＋、３．７５ ｍｍｏｌ／ｌ ｄｎｔｐｓ、２５．００ ｎｇ／μｌ dna模板和１０．００ μｍｏｌ／ｌ引物。 关键词：松阿扁叶蜂（ａｃａｎｔｈｏｌｙｄａ ｐｏｓｔｉｃａｌｉｓ ｍａｔｓｕｍｕｒａ）；ｓｓｒ－ｐｃｒ；正交设计 ａｂｓｔｒａｃｔ： ｉｎ ｏｒｄｅｒ ｔｏ ｅｓｔａｂｌｉｓｈ ｔｈｅ ｓｓｒ－ｐｃｒ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ ｕｓｉｎｇ ｇｅｎｏｍｉｃ ｄｎａ ｏｆ ａｃａｎｔｈｏｌｙｄａ ｐｏｓｔｉｃａｌｉｓ which was ｅｘｔｒａｃｔｅｄ ｂｙ ｓｄｓ－ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ ｋ ｍｅｔｈｏｄ ａｓ ｔｅｍｐｌａｔｅ， ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｄｅｓｉｇｎ ｗａｓ ｕｓｅｄ ｔｏ ｏｐｔｉｍｉｚｅ ｍａｉｎ ｐｃｒ ｆａｃｔｏｒｓ ｓｕｃｈ ａｓ ｔｅｍｐｌａｔｅ ｄｎａ， ｔａｑ ｄｎａ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ， ｍｇ２＋， ｐｒｉｍｅｒ ａｎｄ ｄｎｔｐｓ． ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ｐｃｒ ｓｙｓｔｅｍ ｉｎｃｌｕｄｅｄ 1.00 ｕ ｔａｑ ｄｎａ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ， 3.00 ｍｍｏｌ／ｌ ｍｇ２＋， ３．７５ ｍｍｏｌ／ｌ ｄｎｔｐｓ， 25.00 ｎｇ／μｌ ｄｎａ ｔｅｍｐｌａｔｅ ａｎｄ ２０.00 μｍｏｌ／ｌ ｅａｃｈ ｐｒｉｍｅｒ ｉｎ ｔｈｅ ｔｏｔａｌ ｖｏｌｕｍｅ ２５ μｌ． ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ａｃａｎｔｈｏｌｙｄａ ｐｏｓｔｉｃａｌｉｓ ｍａｔｓｕｍｕｒａ；ｓｓｒ－ｐｃｒ；ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｄｅｓｉｇｎ 松阿扁叶蜂（ａｃａｎｔｈｏｌｙｄａ ｐｏｓｔｉｃａｌｉｓ ｍａｔｓｕｍｕｒａ）是松树的重要食叶害虫之一，其１年发生ｌ代，主要为害油松、黑松、樟子松等，常将当年生和二年生针叶吃光，致使被害松林成橘褐色，严重时８０％以上的针叶被取食，从而严重影响树木生长［１，２］。中国关于松阿扁叶蜂的研究主要集中于其生物学特性［３，４］、发生原因［５，６］、寄主选择［７］、防治技术和预测预报［８，９］等方面，但关于该害虫种群遗传变异的研究至今未见报道。 微卫星（ｓｓｒ）分子标记具有分布广泛、多态性高、稳定性好、操作简便、检测技术简单及共显性遗传等优点，已被广泛应用于物种资源遗传多样性研究、基因分子标记以及昆虫遗传多样性研究等领域。但ｓｓｒ－ｐｃｒ反应结果易受反应体系中多种因素的影响，因此需要对其扩增体系进行优化，然后才能进行后续的试验分析；此外，不同物种所需的ｓｓｒ－ｐｃｒ反应的最佳反应体系一般也不尽相同。 在进行种群遗传多样性的研究中，运用正交设计方法［１０－１２］对影响松阿扁叶蜂ｓｓｒ－ｐｃｒ反应的各因素进行了优化试验，建立了一套适合松阿扁叶蜂ｓｓｒ－ｐｃｒ的反应体系，为应用该技术进行松阿扁叶蜂的种群遗传多样性分析打下基础。 １ 材料与方法 １．１ 材料 １．１．１ 原料 供试材料为２０１０年６月采自陕西省周至县楼观台国家森林公园为害油松的松阿扁叶蜂幼虫，样品保存于体积分数为９５％的乙醇中，带回西北农林科技大学林学院昆虫分子生物学实验室进行基因组ｄｎａ提取。 １．１．２ 试剂与仪器 １０×ｐｃｒ ｂｕｆｆｅｒ（无ｍｇ２＋）、１０ ｍｍｏｌ／ｌ ｄｎｔｐｓ、５ ｕ／μｌ ｔａｑ ｄｎａ聚合酶、２５ ｍｍｏｌ／ｌ ｍｇｃｌ２以及分子质量标准ｄｌ ２０００ ｄｎａ ｍａｒｋｅｒ均购自宝生物公司（大连）有限公司，引物序列由生工生物工程（上海）有限公司合成，稀释成２０ μｍｏｌ／ｌ。ｍａｓｔｅｒｃｙｃｌｅ ｐｒｏ ｓ型ｐｃｒ仪购自德国ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ公司，ｎｄ－１０００微量紫外可见分光光度计购自美国ｎａｎｏｄｒｏｐ公司。 １．２ 方法 １．２．１ 基因组ｄｎａ的提取和浓度测定 采用改良的ｓｄｓ－蛋白酶ｋ法［１３］提取松阿扁叶蜂幼虫基因组ｄｎａ，在１％琼脂糖凝胶上电泳检测提取产物的完整性。用ｎｄ－１０００微量紫外可见分光光度计检测ｄｎａ溶液的浓度和纯度，并将其稀释到２０ ｎｇ／μｌ，于－８０ ℃保存备用。 １．２．２ 退火温度的优化 根据预试验结果，选定引物ｌｉｓｔ２００１［１４］用于ｓｓｒ－ｐｃｒ反应体系的优化。首先在４５～６５ ℃设置４个退火温度即４８．９、５２．７、５７．６和６１．６ ℃