碱性磷酸酶【上课用】介绍.docVIP

碱性磷酸酶的提取及其比活性测定 实验报告 班级： 12级生物一班 小组成员：陈明珠、邓家颖、范洁婷、梁彦珺 指导老师：许华1、实验原理 本实验采取有机溶剂沉淀法从猪肝匀浆液中提取分离碱性磷酸酶 AKP 。正丁醇能使部分杂蛋白变性，过滤除去杂蛋白即为含有AKP的滤液，AKP能溶于终浓度为33％的丙酮或30％的乙醇中，而不溶于终浓度为50％的丙酮或60％的乙醇中，通过离心即可得到初步纯化的AKP。 根据国际酶学委员会规定，酶的比活性 specific activity 用每mg蛋白质具有的酶活性单位 u/mg·pr 来表示。因此，测定样品的比活性必须测定： 1 每ml样品中的蛋白质mg数 mg/m1 ; 2 每ml样品中的酶活性单位数 u/ml 。酶的纯度越高酶的比活性也就越高。 本实验以磷酸苯二钠为底物，由碱性磷酸酶催化水解，生成游离酚和磷酸盐。酚在碱性条件下与4-氨基安替比林作用，经铁氰化钾氧化，生成红色的醌衍生物，颜色深浅和酚的含量成正比。于510nm处比色，即可求出反应过程中产生的酚含量，而碱性磷酸酶的活性单位 King-Armstrong法 可定义为：在37℃保温15min每产生lmg的酚为一个酶活性单位（U）。 样品中蛋白质含量测定用考马斯亮蓝法测定。 2、实验试剂 1．0.5mol/L乙酸镁溶液：称取乙酸镁107.25g溶于蒸馏水中，稀释至1000ml。 2．