蛋白复性.docVIP

包涵体的变性及复性1×Binding Buffer作裂解液，超声波破碎后，获得的包涵体1×Binding Buffer溶解，室温静置至完全溶解； 充分溶解后，，加入用1×Binding Buffer配制的0.2%PEG2000和0.1mM GSSG：1mM GSH，0.1mM Arg，5-10% Glycerol），最后用1×Binding Buffer稀释蛋白至原菌液体积，调整pH（具体值视蛋白情况定，避开pI），装入透析袋中； 用20倍体积的1×Binding Buffer进行4℃透析复性，每2h换一次，6次换液后，离心收集蛋白液； 按可溶性蛋白纯化，注意保持低温环境，防止蛋白降解。 注意： 透析液中的添加剂的浓度要在实验中摸索，每种蛋白的要求可能不同。 复性过程的添加剂： 1、共溶剂：如PEG6000-20000，据说可以可逆的修饰折叠中间体的疏水集团，此外由于阻止了蛋白质分子间的相互接触的机会，也可能对复性效率的提高起作用。一般的使用浓度在0.1%左右，具体条件可根据实验条件确定。 2、二硫键异构酶（PDI）和脯氨酸异构酶（PPI）：PDI可以使错配的二硫键打开并重新组合，从而有利于恢复到正常的结构，此外在复性过程中蛋白质的脯氨酸两种构象间的转变需要较高能量，常常是复性过程中的限速步骤，而PPI的作用是促进两种构象间的转变，从而促进复性的进行。 3、分子伴侣，即热休克蛋白（