聚合卵巢的肾囊移植手术操作介绍.docVIP

供体细胞的聚合操作 青岛农业大学动物生殖发育与基因工程研究所 陈波 flamingcb@163.com 1、在聚合前，先平衡铺有琼脂的30mmα培养皿：在α培养皿中铺上一层薄薄的琼脂，待琼脂后，向其中加入1ml 含10% FCS的αMEM培养液，放入37℃、饱和湿度、5%CO2培养箱中。如此反复洗3次，每次15min。 2、把待聚合的细胞混合均匀，转移到0.5ml离心管中（注意用培养液洗下平皿），3500rpm，离心3min，弃上清。 3、加入400μl BSA培养液细胞，3500rpm，离心3min，弃上清，尽量把上清吸干净。 4、加入BSA培养液100μl，加入0.02g植物凝集素，使其终浓度为0.2mg/ml，37℃、饱和湿度、5%CO2培养箱平衡10min，平衡过程中震荡数次。 5、12000rpm，离心10s，将离心管旋转180°，12000rpm，离心30s。 6、用刀片削去一部分，以便能吸入把离心管中的组织块用枪吸到平衡好的30mm α培养皿中，加入适量含10% FCS的αMEM培养液在保证组织不至于悬浮在培养液中的前提下尽量多加一些——这点很重要将培养皿倒置放入37℃、饱和湿度、5%CO2培养箱培养。 7、培养24h后的聚合卵巢会开始渐渐聚拢，形成圆饼状；培养48h后的聚合卵巢则形成圆球形，明显高出培养液液面，边缘形成清晰的界面，用镊子可以反复夹起而不变形。聚合的卵巢一定要培养到供体有稳定的形状后再移植，否则在肾包囊的压力下供体会被压扁而无法成团，也就无法支持卵泡发生（这是血的教训）！！！P8090-5植物血球凝集素 PPHA-P Sigma 5mg 2、5mg/ml植物凝集素的配制： PHA-P 5mg 0.01M PBS（超纯水配制） 1ml 配制时，直接向试剂管内加1mlPBS，盖上盖子，反复颠倒数十下后静置数分钟待药品溶解，5000rpm离心10s。 配好后用PCR管每管50μl分装℃保存。 使用浓度：0.2m/ml（即每100μl使用4μl/tools/mousework/Cunha001/Pages/Written_Method.html 该网址图解了手术过程，施术前请仔细参读。 另附本文作者基于此技术发表的文章一篇，欢迎大家引用，谢谢：Recovery of functional oocytes from cultured premeiotic germ cells after kidney capsule transplantation. Stem Cells Dev. 2013 Feb 15;22(4):567-80. 链接：/doi/abs/10.1089/scd.2012.0436  Avertin 储存液浓度 1.2% 工作液浓度 0.2 ml/10g或240 mg/kg 储存液、工作液均4℃避光保存，使用前现配。 储存液： 三溴乙醇[Sigma-Aldrich, #T4,840-2] 25克 1g 0 叔戊醇[国产分析纯] 15.5ml 0.62ml 0.5ml 在室温溶解12h，4℃避光保存 工作液： 储存液 0.5ml 0.1ml 生理盐水 39.5ml 7.9ml 过滤后于4℃避光保存 剂量： 胚胎移植 0.45-0.55 ml 　 IP注射 活组织检查＞1.0ml注射后，动物在5min左右进入麻醉状态，需要的话可以补注