聚磷菌的培养介绍.docVIP

聚磷菌的培养 背景：污水中的磷和氮含量过高是造成水体富营养化的主要因素。而其中的磷不像氮那样可以结合氧转化为气体，含磷的气态物质（PH3）又不易转化，所以污水除磷一直都用生物除磷法。即用细菌等微生物来摄取水中的磷，达到除磷的效果。而为了提高微生物除磷的效率、便于和其他材料协同使用，筛选、培养除磷细菌也是必不可少的工作。 培养菌种\菌落：聚磷菌（PAOs） 菌落来源：废水除磷工艺中的活性污泥 菌落组成：主要由β—2亚群紫色细菌、不动杆菌、红环菌属和绿单胞菌属组成；其中不动杆菌为主导细菌，除磷作用突出 聚磷菌除磷机理： 好氧条件下，聚磷菌不断摄取并氧化分解有机物，产生的能量一部分用于磷的吸收和聚磷的合成，一部分则使ADP与H3PO4结合，转化为ATP而储存起来。细菌以聚磷的形式在细胞中储存磷，其量可以超过生长所需，这一过程称为聚磷菌磷的摄取。处理过程中，通过从系统中排除高磷污泥以达到除磷的目的。 在厌氧条件下，聚磷菌体内的ATP进行水解，放出H3PO4和能量，形成ADP。这一过程称为聚磷菌磷的释放。 聚磷菌除磷则就是通过以上两种过程完成的。 培养过程： 1、材料准备 1.1取样： 从实验室运行稳定 的厌氧\缺氧SBR反应器中，取富含反硝化聚磷菌的活性污泥做为实验样品。 1.2培养基配方： ( 1 ) 牛肉膏蛋白胨培养基（L）： 蛋白胨 10 g；牛肉膏3 g；NaCl 5 g；琼脂20 g ；p H 7.2 ， 用于反硝化聚磷菌的分离、 纯化 ( 2) 缺磷培养基（L）：CH3COONa 2g ；Na2HPO4·2H2O 23 mg； CaCL2·2H2O 11 mg； NH4C1 152.8mg；MgSO4·7H2O 81.12 mg；K2SO4 17.83 mg； HEPES缓冲液7 g；微量元素 2 mL； p H 7.2 ( 3) 富磷培养基（L）：CH3COONa 2g； K2PO4 25mg；NH4C1 305.52 mg； MgSO4·7H2O 91.26 mg； CaC12·2H2O 25.68mg； PIPES缓冲液8.5 g ； 2 m L 微量元素； p H 7 .2 ( 4 ) 硝酸盐还原产气试验培养基（L）：牛肉膏3 g ；蛋白胨5g ；KNO3 1 g ； p H 7.4 。 2~4类培养基用于反硝化聚磷菌的筛选。 2、培养基制作 2.1牛肉膏蛋白胨培养基 A 根据需要计算每个培养基所需要的药品质量 B 按培养基配方、具体计算量和比例依次准确地称取牛肉膏、蛋白胨、NaCl放入烧杯中。(牛肉膏可用玻棒挑取，放在小烧杯或表面皿中称量，用热水溶化后倒入烧杯) C先在上述烧杯中加入少于所需要的水量，用玻棒搅匀，再将称好的琼脂放入已溶化的药品中，然后在石棉网上加热使其溶解、溶化。（在琼脂溶化的过程中，需不断搅拌，以防琼脂糊底使烧杯破裂）最后补足所失的水分到所需的总体积。 D 用精密pH试纸测量培养基的原始pH值，如果pH偏酸，用滴管向培养基中逐滴加入1mol/L NaOH，边加边搅拌，直至pH达7．2。反之，则用1mol/L HCl进行调节。（注意pH值不要调过头，以避免回调） E 将或加热融化后的培养基冷至50℃左右，以无菌手续倾人灭菌平皿内，轻摇平皿底，使培养基平铺于平皿底部，再次高压灭菌，之后待其凝固即可。（灭菌后的培养基放入37℃养箱中培养24小时，以检验灭菌的效果A 根据需要计算每个培养基所需要的药品质量 B 按培养基配方、具体计算量和比例依次准确地称取各类药品。先在三角烧瓶中加入少量蒸馏水，再加入各种称量好的药品 C 搅拌、适当加热使药品溶解，并加蒸馏水至所需体积 D用精密pH试纸测量培养基的原始pH值，如果pH偏酸，用滴管向培养基中逐滴加入1mol/L NaOH，边加边搅拌，直至pH达7．2。反之，则用1mol/L HCl进行调节。（注意pH值不要调过头，以避免回调） E用滤纸过滤，直至液体培养基清晰便于观察即可 F根据需要将培养基分装于各个三角烧瓶中，高压灭菌。（灭菌后的培养基放入37℃养箱中培养24小时，以检验灭菌的效果灭菌后的培养基放入37℃养箱中培养24小时，以检验灭菌的效果分离、纯化。 2.2菌株初筛： A）选取分离、纯化后所得斜面菌种，首先在缺磷的乙酸合成培养基中进行预培养（按分组）：先用1 mol／L的氢氧化钠将pH值调到7，然后各组培养物在30℃、140r／min的摇床上过夜培养。 B）菌体细胞以10000r／min离心出来，之后用无菌蒸馏水洗涤、离心，重新悬浮于富磷培养基中（整个过程均在无菌操作台上进行） ，然后在30℃摇床中进行扩大培养 ， C）培养24h后，每组大约取10