基于TALE的靶向基因修饰技术 -方金辉.pptxVIP

PrecisiongenomeengineeringbasedonTALE基于TALE的靶向基因修饰技术硕生命1504方金辉2015.11.10报告纲要一、TALENs的研究背景二、TALENs的原理三、TALENs的操作要点四、TALENs的应用五、未解决的问题1报告纲要一、TALENs的研究背景二、TALENs的原理三、TALENs的操作要点四、TALENs的应用五、未解决的问题2我们研究一个生物的性状，最终都需要做一件事：改变基因，从必要性和充分性两方面阐明基因功能。1）Lossfunction：降低基因或删除基因Givefunction:提高基因的表达一、TALENs的研究背景3生物学家的梦想：随心所欲地操作基因划时代的基因靶向操作技术：TALE与CRISPR/Cas9使靶向操作不再是梦我们不再大海捞针！！！经典基因操作：Genetrap:化学诱变；转座子--------海量的筛选+goodLuck同源重组：一般物种几率低,10-6；EScell10-2难！3.突破性的发现：RNAi-Knockdown;不完全敲除，临时性。4.充满梦想却幻灭的ZFN：难以完全找到匹配的3连子锌；Off-target严重。美国加州大学DaveSegal教授说：“Withzincfingers,wehavetolettheDNAtelluswherewetarget”5.完美基因靶向操作：识别特异DNA序列结构+操作DNA的酶45TALEN技术形成的关键研究SugisakiHiroyukiJensBoch发现FokI核酸酶破译TALE序列（1981）（2009）DanielF.VoytasAdamJ.Bogdanove将TALEDNA结合motif与FokI核酸酶融合，推出与ZFN同类型的双链DNA剪刀，称之为TALEN。(2011)TALE的发现迅速成为科技最前沿报告纲要一、TALENs的研究背景二、TALENs的原理三、TALENs的操作要点四、TALENs的应用五、未解决的问题6TALE蛋白中间含有一个重复区域，该区域由33-35个氨基酸的重复单元组成。每个重复单元的氨基酸序列高度保守，但第12位和13位的两个氨基酸可变，称为重复单元可变的双氨基酸残基（RVD）。TALE单体通过RVD识别DNA靶点上的碱基，有如下一一对应关系：NG=T,HD=C,NI=A,NN=GorA，NH=G。二、TALENs的原理（重复可变双残基）RVD类型：TALE的结构7DongDengetal.,Science5January2012,121:5670TALE的空间结构82011年，把C端的转录激活子替换为FokI核酸内切酶，首次实现了TALE蛋白的人工改造，并显示具有良好的效果。9FokI核酸内切酶切割DNA无序列特异性，FokI通常需要以二聚体的形式发挥其切割DNA序列的功能：1011TALENs——识别任意特定核酸靶序列的重组核酸酶构建TALE与核酸内切酶FokI的融合蛋白FokI需形成二聚体才具有活性，因此在目标DNA中选择两处靶序列，形成TALEN对TALE是识别靶基因，FokI则起了切割DNA的作用特异位点打断目标基因组DNA序列，从而可在该位点进行DNA编辑修饰操作切割后（细胞DNA损伤后）会启动两种修复机制过程，一种为末端非同源依赖的修复机制(NHEJ)，另一种是依赖同源重组的修复机制(HDR)：引入突变造成基因敲进和修改1213TALENs靶向基因修饰的原理14基于TALEN的基因修饰geneknock-outgeneknock-ingenetaggingnucleotidesubstitutionproteintruncation报告纲要一、TALENs的研究背景二、TALENs的原理三、TALENs的操作要点四、TALENs的应用五、未解决的问题15三、TALENs的操作要点从选定的目标序列中寻找合适的TALE候选靶位点(如果目的是突变基因，一般选择比较靠前的外显子中的靶位点)，选择的DNA序列5端第一个碱基最好为T2.获取针对靶序列的特异TALE蛋白选择合适的FokI结构域，利用分子生物学的方法把TALE和FokI组装在一起构建完整的TALEN蛋白将完整的TALEN引入细胞进行基因组定点修饰操作筛选阳性克隆，评价效果以上并不是每个TALEN必经的步骤，有的会在第三步与第四步之间加入酵母双杂交等评估，首先确定其活性，然后再用于实验.关键16目前，已发展的TALEN组装方法：基于GoldenGate（GG）克隆的方法：（1）基于PCR的GG法（GG-PCR）通过PCR扩增TALE重复单元，用IIS型内切酶产生多种一一对应、特异匹配的粘性末端对。一次可以连接4~6个TALE重复单元。（2）传统的基于质粒载体的GG法（GG-Vec