PpKO的同建模101009.docVIP

梨贝壳杉烯氧化酶（PpKO）三维结构的同源模建及功能预测 摘 要：以本试验室已克隆获得的梨贝壳杉烯氧化酶PpKO为试材，以人的微粒体细胞色素P450的A链的晶体结构为模板，综合运用生物信息学方法及分子模拟手段，构建了与其高度同源、催化功能相似的晶体结构。通过Structure assessment和SAVS对模建结构的合理性进行了分析，结果表明利用Swiss－Model同源模建结果较好。在此基础上，运用细胞色素P450酶系催化循环酶促动力学对PpKO的催化机理进行了初步分析，这为揭示贝壳杉烯氧化酶（KO）的生物学功能及抑制剂药物分子设计提供了有益的信息。 关键词：贝壳杉烯氧化酶；同源模建；蛋白质三维结构 贝壳杉烯氧化酶（KO）是赤霉素合成途径中的关键酶（Hedden，1997），位于内质网且与叶绿体膜结合的依赖细胞色素P450(CYP450)和NADPH的单加氧酶。通过三步连续的羟基化作用，将内根－贝壳杉烯的C－19甲基氧化，分别形成内根－贝壳杉烯醇、内根－贝壳杉烯醛和内根－贝壳杉烯酸（Helliwell，1999），该过程使6碳的B环转化为5碳的C环，从而形成赤霉素的母环结构(Lange，1998)。 NCBI保守域分析表明PpKO属于细胞色素超家族P450系。细胞色素P450家族成员之间的一级结构差异较大，但空间结构却有着较大的相似性，含有由含亚铁血红素和半胱氨酸组成的活性中心（Rupasinghe，2006）。目前数据库中已有经实验获得的晶体结构，较易获得模建所需的模板。不过，我们在PDB数据库中搜索发现，目前尚无KO X光晶体衍射的晶体结构，只有拟南芥（UniProt：Q93ZB2）和赤霉菌（UniProt：A9P5P8）的同源模建晶体结构。KO三维结构详细信息的缺失必然阻碍对其功能的理解和药物开发的滞后。 同源模拟法是根据同源蛋白质三级结构的保守性超过蛋白质序列的理论，通常在蛋白质序列上稍微的改变其三级结构亦改变很小。在蛋白质序列之一致性（identity）大于30% 的前提下，一个未知结构的蛋白质可以利用一个或一个以上与其相关的结构来建立其三维结构。当然，蛋白质间的序列一致性越高，所建立的三维结构其准确性（accuracy）越高（Martí-Renom et al.,2000）。同源模拟法是现代生物科技中不可或缺的技术，通过同源模建可以推测蛋白质的活性位点，进行分子对接研究，并进行分子动力学研究。 本试验通过使用同源模建方法构建了梨贝壳杉烯氧化酶（PpKO）的三维结构，以期找到一些有助于研究贝壳杉烯氧化酶蛋白结构与其功能关系的规律。 材料和方法 1.1 材料 供试梨贝壳杉烯氧化酶（PpKO）蛋白质序列(GenBank:ADE61678)，为青岛农业大学园林园艺学院果树学实验室通过RACE方法克隆获得的基因PpKO（GenBank: HM003112）推导而来的，共计有515个氨基酸残基。 通常来说，一个同源模建的过程包括 (1)资料库搜寻及选择模板（templates）； (2)多重序列排列（multiple sequence alignment）； (3)骨架（framework）的建构，环状结构（loop）模拟以及侧链（side-chain）模拟； (4)能量最小化（energy minimization）； (5)结构合理性评价。 在整个的蛋白质结构预测过程中，模板的筛选和对目标序列的模建对于最终的建模影响最大。本试验均采用多种方法来提高这个过程的精度，这对整个蛋白质结构预测过程有很重要的作用。 1.2 用于模建的数据库及网址 模建模版搜索使用PSI-BLAST程序网址为：http://myhits.isb-sib.ch/cgi-bin/psi_blast 。 模型评价使用UCLA-DOE的SAVEs在线蛋白检测服务器网址为：/SAVES/ 1.3 模板的筛选 同源建模法（Homology）需要至少有一个已知结构且和目标序列相似的序列。一般利用FASTA、BLAST或者PSI-BLAST在PDB的子集上进行搜索，通常，FASTA分数大于10或者BLASTp期望分数小于1e-5的序列可以作为模板用来建模，模板序列的选择应进一步满足与目标序列的40%或至少有25%的序列组成相似性。 本试验以PpKO序列为探针，利用PSI-BLAST程序搜PDB数据库，选取序列相似性以及结构分辨率均最高的蛋白质作为模板，结果表明人的微粒体P450 1A2（PDB code: 2HI4）的A链相似度最高：FASTA比特分数302，BLAST p期望分数1e-27，一致性百分比为119/476(25%)，相似性百分比为205/476 (43%)。2HI4是通过晶体衍射方法测定的，其主要参数为：分辨率?（Resolution）为1.95