台湾海鱼棘头虫相并以核糖体DNA序列鉴别三种棘头虫介绍.doc

台湾海鱼棘头虫相并以核糖体DNA序列鉴别三种棘头虫 摘要： 从三种鱼类寄主中，我们发现并鉴别了三个种的棘头虫。它们分别来自乌鱼体内的新棘吻虫、鱼豚体内的巨棘新长棘吻虫以及鲭鱼体内的锯长棘吻虫。三种棘头虫都是发现地点的新纪录。该研究用到了扫描电子显微镜和光学显微镜来描述棘头虫的形态学特征。除此之外，该研究还用分子研究方法来区别三者遗传上的差异。用PCR方法扩增核糖体DNA片段ITS-1、5.8S和第二个转录片段ITS-2，获得的产物长度不同，并以此来区别三种棘头虫。它们的长度分别为：新棘吻虫450bp，巨棘新长棘吻虫800bp，锯长棘吻虫600bp。 关键词：棘头虫 海鱼 新棘吻虫属 巨棘新长棘吻虫属 锯长棘吻虫属 引言： 棘头虫是一种头部多刺或者说吻钩的蠕虫，它的吻可以翻转并具有吻钩，它们凭借吻钩可以刺穿并附着在有颌类寄主的胆壁上。棘头虫是一种体内寄生虫，一般寄生在寄主的肠中。它们通常有复杂的生活史，涉及大量的寄主，包括作为中间宿主节肢动物和作为最终寄主的鱼类、两栖类、鸟类以及哺乳类。目前已经发现了大概1150种棘头虫。在人类和兽类医学领域，棘头虫没有受到太大的重视。人类感染棘头虫的情况只发生在中国大陆的某些地区和其他一些零星的地区。相对于其他寄生蠕虫，棘头虫的感染力并不强，所以很少有关于棘头虫感染鱼类引起鱼类重病或者高死亡率的报道。 棘头虫在鱼类体内并不仅仅是肠道寄生虫。祖雷斯贝尔等人表明，某些寄生虫尤其是寄生在鱼类肠道的棘头虫和绦虫与那些寄生在寄主组织中或者外环境中的蠕虫相比，会积累更高浓度的重金属。这种明显的重金属积累现象使得鱼类棘头虫被应用到环境监控中。也因此，棘头虫在近十年里受到了生态学者和环境毒理学者的重视。 感染鱼类的棘头虫成虫分为两个科，分别是Eoacanthocephala和Palaeacanthocephala。前者包括两个属：Cyracanthocephala和Neoacanthocephala，后者也包括两个属：Echinorhynchidea和Polymorphida（Amin，1987）。之前就对棘头虫的种、属、科、亚科的特有的形态学特征进行了描述。 为了精确有效地鉴定蠕虫的种类，近年来做了大量的研究表明转录片段ITS和rDNA片段5.8S可以作为区分寄生线虫和棘头虫的标记基因。聚合酶反应琏（PCR）和先进的试验技术，例如PCR-SSCP（单琏构象多态性），帮助科研工作者完成了大量试验，使得寄生蠕虫的记录名单迅速增长。 这个实验的目的是为了给那些从台湾一些常见的或者对环境有重要作用的海鱼体内发现的棘头虫编制分类目录。这是第一篇关于这个课题的报告。除了形态学特征，该研究根据三种棘头虫的ITS和5.8S rDNA片段的不同作了分子描述。 材料和方法： 样本搜集 从Keelung、伊朗、台湾的渔人那里买到了包括河豚、鲭鱼和乌鱼在内的海鱼，并送到了实验室。经过鉴定分类之后，我们解剖了它们的腹部，在自来水中清洗并从它们的胃肠道中尤其是肠的底部搜集了一些棘头虫。对棘头虫进行反复清洗除去它表面的粘液和残留的鳞片，随后浸泡在70%的酒精中储存备用。 棘头虫的形态学鉴定 挑选较好的棘头虫样本浸泡在甘油和70%酒精的混合液中（1：1 V/V）。经过清洗之后固定在载玻片上并在显微镜下观察，根据棘头虫科和亚科的分类要点对它们进行形态学上的分类。 为了揭露棘头虫的吻部及表面棘的超微结构，我们用到了扫描电子显微镜。首先将棘头虫浸泡在1%的戊二醛12h，然后在OsO4中固定1h。对棘头虫进行脱水，临界点干燥，离子溅射镀膜等处理。在15kV电压的扫描电镜下观察蠕虫。 棘头虫分子学鉴定 在立体显微镜下用无菌解剖针样品中挑选出用于提取DNA的棘头虫样本。每个样本都需在5%的甘油和10%的酒精混合液中储存，然后各自用甘油固定在载玻片上并盖上盖玻片。分类学鉴定之后把棘头虫样品分别放到2ml的PC管里，加入缓冲液、7mg／ml的蛋白酶K总共500μL，在55℃的环境下放置直到细胞完全溶解，加入135μL的蛋白质沉淀溶液，500微升异丙醇和乙醇混合物以及150微升的水化溶液扩增DNA。 为了扩增包括ITS-1、ITS-2和5.8S rRNA这几个DNA片段，用到了引物DNA序列（）。PCR体系包括5微升的要扩增的DNA，5μL含MgCl2和BSA的10× buffer，6μL的dNTPs，4.6μL的酶稀释液，0.4μL的DNA聚合酶（5U/μL，BIOTAQ）和蒸馏水，每个样品的体积为50μL。循环温度为℃ 3min，℃ 1min，℃ 1min，℃ 1min ，72℃ 10min35个循环，最后保持在℃。把PCR产物放在以TBE缓冲的2%的琼脂凝胶中。在200V的电压下进行凝胶电泳。 结论 在三种鱼类寄主中分离鉴定了三种棘头虫。这三种棘头