WesternBlot操作流程介绍.docVIP

Western-Blot操作流程1. 试剂配制1.1母液1.1.1??1.0mol/L Tris?HCl Tris MW121.14 30.29g蒸馏水 200ml溶解后，用浓盐酸调pH至所需点（见下所示），最后用蒸馏水定容至250ml，高温灭菌后室温下保存。?PH HCl7.4 约17ml7.5 约16m7.6 约15ml8.0 约10ml1.1.2 1.74mg/ml 10mmol/L PMSFPMSF 0.174g异丙醇 100ml溶解后，分装于1.5ml离心管中，-20℃保存。1.1.3 0.2mol/L NaH2PO4?NaH2PO4（MW119.98） 12g蒸馏水至 500ml溶解后，高压灭菌，室温保存。1.1.4 0.2mol/LNa2HPO4?Na2HPO ?12H2O（MW 358.14） 71.6g蒸馏水至 1000ml溶解后，高压灭菌，室温保存。1.1.5 10％SDS??SDS 10g蒸馏水至 100ml50℃水浴下溶解，室温保存。如在长期保存中出现沉淀，水浴溶化后，仍可使用。1.1.6 10％过硫酸胺（AP）?过硫酸胺 0.1g超纯水 1.0ml溶解后，4℃保存，保存时间为1周。（可先将过硫酸胺干粉称好分量后放在EP管中，一次性多装几管，使用时加入超纯水即可）1.1.7 1.5mol/L Tris?HCl（pH8.8）?Tris MW121.14 45.43g超纯水 200ml溶解后，用浓盐酸调pH至8.8，最后用超纯水定容至250ml，室温下保存。1.1.8 0.5mol/L Tris?HCl（pH6.8）?Tris MW121.14 15.14g超纯水 200ml溶解后，用浓盐酸调pH至6.8，最后用超纯水定容至250ml，室温下保存。1.1.9 40％Acr/Bic（37.5:1）?丙稀酰胺（Acr） 37.5g甲叉双丙稀酰胺（Bic）? ?1g超纯水至 100ml溶解后4℃保存。使用时恢复至室温且无沉淀。1.1.10 30％Acr/Bic（29:1）?丙稀酰胺（Acr） 29g甲叉双丙稀酰胺（Bic）? ?1g超纯水至 100ml溶解后4℃保存。使用时恢复至室温且无沉淀。1.1.11 20％Tween20?Tween20 20ml蒸馏水至 100ml混匀后4℃保存。1.2 使用液配制1.2.1??单去污剂裂解液（PMSF）：?1mol/L Tris?HCl（pH8.0）??2.5mlNaCl 0.438g?TritonX-100 0.5ml蒸馏水至 50ml混匀后4℃保存。使用时，加入PMSF至终浓度为100μg/ml（0.87ml裂解液加入1.74mg/ml PMSF50μl）。一般实际用的比较多的其实是RIPA-Radio Immunoprecipitation Assay裂解配方：50 mM Tris-HCl pH 7.4、150 mM NaCl、1 mM PMSF、1 mM EDTA、1% Triton X-100、1%脱氧胆酸钠、0.1% SDS。 裂解得到的蛋白样品，由于含有较高的蛋白去垢剂干扰，不能用Brandford法测定蛋白浓度,要用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度。 RIPA裂解液的配方有很多种，根据其裂解液的强度大致可以分为强、中、弱三类。对于某些特殊蛋白的IP，如果发现Western及IP细胞裂解液 弱 效果不是非常理想，可以尝试用RIPA裂解液 强、中或弱 。如果发现IP的时候背景很高，即非特异的蛋白也被IP下来，则需要选用裂解强度较高的裂解液，例如RIPA裂解液 强或中 。如果发现目的蛋白无法被IP下来，则说明裂解液的强度过强，可以使用较为温和的裂解液例如RIPA裂解液 弱 或NP-40裂解液。 对于某些难溶解蛋白的Western，如果发现Western及IP细胞裂解液 弱 效果不是非常理想，可以尝试使用裂解强度更高的裂解液例如RIPA裂解液 强、中 或SDS裂解液。1.2.2??0.01mol/L PBS（ pH 7.2-7.4）0.2 mol/L NaH2PO4 19ml0.2 mol/L Na2HPO4 81mlNaCl 17g蒸馏水至 2000ml1.2.3 G250考马斯亮蓝溶液（蛋白定量专用）?考马斯亮蓝G250 100mg95％乙醇 50ml磷酸 100ml蒸馏水至 1000ml配制时，先用乙醇溶解考马斯亮蓝染料，再加入磷酸和水，混匀后，用滤纸过滤，4℃保存。1.2.4 0.15 mol/L NaCl?NaCl（MW58.44）? ?0.877g蒸馏水至 100 ml高温灭菌后，室温保存。