PCR法检测HBV介绍.docVIP

PCR法检测HBV 摘要：目的 了解乙型肝炎病毒的相关知识及PCR技术在乙型肝炎病毒检测方面的应用，并通过实验的方法加深理解。方法 将已导入乙肝病毒特定段基因的质粒用基因扩增仪进行扩增，然后分两组进行电泳，并设置阴性对照、阳性对照、空白对照和Marker对照组。电泳完毕后将胶板放在UVP凝胶成像系统下观察，对照。结果 实验组1弱阳性， 实验组2阴性。 讨论 分析了实验结果及误差产生的可能原因。 关键词：HBV PCR 琼脂糖凝胶电泳 引言 1.现状 乙型肝炎病毒感染是一个全球性的公共卫生问题。据估计，全世界大约有20亿人是过去或现在的HBV感染者以及超过350万人长期感染乙肝病毒。在受感染的青少年或成人中， 5 ％ -10 ％将发展成慢性携带者，而在受感染的新生儿达90 ％慢性化发展。在慢性HBV感染者中， 70 ％ -80 ％可以持续正常多年或终身。进一步持续病毒感染，可以导致慢性活动性肝炎，甚至可能发展至肝硬化和肝癌。[1]在我国，乙肝病毒携带者约有1.2亿人。 2.HBV 的形态与结构[2] 感染者血清中用电镜观察可见三种不同形态的HBV颗粒，即大球形颗粒、小球形颗粒和管形颗粒。 大球形颗粒亦称Dane颗粒，是具有感染型的完整成熟的HBV，呈球形。病毒外层有7nm厚的包膜，内层为病毒核心（核衣壳）结构，成二十面体立体对称。HBV核心内部含有双股不完全环状的DNA基因组和DNA多聚酶。小球形颗粒，主要为HbsAg，不含HBV DNA和DNA多聚酶，无感染性。管形颗粒，是由小球形颗粒“串联”而成，不含病毒核酸，无传染性。 3.HBV基因结构及抗原组成[3] HBV-DNA分为负链 长链 及正链 短链 ，其中负链有4个开放阅读框架，分别称为S、C、P和X基因区，他们彼此间相互重叠，以不同的启动子编码多种蛋白。 ⑴S基因区： S区基因有3个不同的启动子，分别形成S基因、PreS1基因与PreS2基因，分别编码HbsAg、PreS1Ag和PreS2Ag三种包膜蛋白多肽； ⑵C基因区： 由前C基因和C基因组成,分别编码HBeAg及HBcAg； ⑶P基因区： P区基因最长，编码HBV-DNA多聚酶、反转录酶及RNA酶H（Rnase H）等； ⑷X基因区： X区基因编码的蛋白称为HbxAg，可反式激活HBV 的基因，增强HBV 基因的复制和表达。 4.HBV的检测 近二十年以来，人们在乙肝诊断方法方面做了大量的研究工作。早期阶段主要应用生化检查方法即肝功能检查，还有免疫学方法，主要采用血清学方法检测血清HBV抗原、抗体，检测HBV DNA 多聚酶等。近来随着分子生物学的快速发展，分子生物学技术检测血清HBV DNA（ HBV感染的直接标志）的方法开始被应用于乙肝的诊断，并且不断发展完善。 聚合酶链反应 Polymerase Chain Reaction ,PCR 是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。 它具有特异、敏感、产率高、 快速、 简便、重复性好、易自动化等突出优点；能在一个试管内将所要研究的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍。将PCR技术和琼脂糖凝胶电泳结合，可用于HBV DNA的检测，并且具有以上优点。[4] 实验材料和主要实验仪器 模板：重组质粒（将乙肝病毒特定段基因导入到质粒中） 特异性引物 上游引物：5’-CACCTCCTCCTGCCTCCACCAATC-3’ 1299-1322 24 bp 下游引物：5’-GGCCCCCAATACCACATCATCCAT-3’ 2133-2157 24bp DdH2O,缓冲液10×buffer+Mg2+，dNTP,Taq 溴酚兰 ：BIOER，Lot NO.座机电话号码,storage -20℃ Marker：BIOER，BioDL2000，Lot NO.座机电话号码 电泳仪，生产厂家：北京百晶生物技术有限公司，型号BG-Power600 基因扩增仪，生产厂家：EPPENDOF UVP Bioimaging systems，American UVP corporation，GDS-8000 system 微型漩涡混合器，上海康华仪器制造有限公司，型号WH861 10.微量加样器，生产厂家：北京百晶生物技术有限公司 11.EP管 实验方法 PCR ⑴将反应体系各成分加入EP管中，用微型漩涡混合器震荡混匀，各种成分的量见下表： DdH2O 缓冲液 引物1 引物2 dNTP Tap 总量 体积 （μl） 99 15 6 6 12 1.2 139.2 ⑵从管中分别吸取23μl混合液加入到另外5 个EP管中，然后分别向其中4个管中加入阴性对照、阳性对照、实验组1、实验组2四种模板2μl，另一管中加入2μlH2O做空白对照。 ⑶将以上五管放入离心机