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第二章 培养基灭菌  微生物的培养过程： 培养基配制→灭菌→接种→培养 为什么要进行培养基灭菌？ 1)???生物反应的基质或产物因杂菌的消耗而损失，造成生产能力的下降。 2)???由于杂菌所产生的一些代谢产物改变了发酵液的某些理化性质，使目标产物的提取困难，造成收得率降低或使产品质量下降。 3)???污染的杂菌可能会分解产物，而使生产失效。 4)???发生噬菌体污染，微生物细胞被裂解，而使生产失效。 需要无菌的单元和措施: 1)培养基和设备需经灭菌 2)好氧培养过程中使用的空气应经除菌处理 3)设备应严密，生物反应器中要维持高于环境压力 4)?使用无污染的纯粹种子 5)培养过程中加入的物料也要经过灭菌 无菌状态: 从系统中杀死或者清除所有活 的微生物和他们的孢子. 培养基的灭菌：杀灭或者除去培养基中有 生活能力的细菌营养体及其孢子。杀灭比 除去杂菌更加常用。 灭菌:是指用物理或化学方法杀灭物料或设备中的一切生命物质的过程。 常用的灭菌方法 : 湿热灭菌Steam Sterilization (121℃,20-30min） 干热灭菌Dry heat sterilization （160℃保温1～2h,玻璃器皿等） 化学除菌 过滤除菌Filtration(澄清流体的除菌,air ) 射线灭菌Irradiation （紫外线穿透力低，仅用于表面消毒和空气的消毒） 进行培养基灭菌的操作方式 分批（间歇）灭菌 连续灭菌 对液体培养基的湿热灭菌是指：将培养基中杂菌总 数N0杀灭到可以接受的总数N，至于所需的温度和 时间，决定于 杂菌孢子的热死灭动力学 培养基中有效成分受热破坏的可接受程度 反应器的形式和操作方法 ? 微生物的热死灭动力学（对数残留定律） 对培养基进行湿热灭菌时，培养基中的微生物受热死亡（微生物体内蛋白质变性）的速率与残存的微生物数量成正比。 上式适合于灭菌过程的任意时刻。为了对灭菌全过程进行考虑，上式作 变上限积分，取边界条件t0=0 N=N0 积分式： 将存活率 与灭菌时间t在半对数坐标纸上标绘可以得到直线。直线斜率K。 K（比热死亡速率常数）由两个因素决定 1、灭菌温度 2、微生物的种类和存在方式 在一定温度下，比热死亡速率常数K随微生物种类不同而不同。例如，在121℃， 枯草芽胞杆菌FS5230的K：0.047～0.063s-1；梭状芽胞杆菌PA3679的K：0.03 s-1； 嗜热脂肪杆菌FS1518的K：0.013 s-1。 即使同一种微生物，其营养细胞和芽胞的K值也有很大的差别，营养细胞易于受热死亡，K值很高。120℃灭菌K值可大致为1010（min-1）数量级，而细菌孢子的K值在120℃只有10数量级，下表是典型微生物培养环境中各种微生物对湿热灭菌的相对热阻。 微生物的热死灭动力学  微生物的热死灭动力学 K除了决定于菌体的种类或存在的方式以外，更重要的是温度T对K的影响，这是热灭菌工程设计中的核心问题。（在什么温度下灭菌好？） K随着温度的变化而变化。研究结果表明，温度和菌种与K的关系可用阿伦尼乌斯方程来表示： 微生物的热死灭动力学 在对培养基进行热灭菌时，在杂菌死亡的同时，培养基中一些不太稳定的成分也会因受热而破坏，例如：糖溶液会焦化，蛋白质会变性，维生素失去活性，醛糖与氨基化合物反应——美拉德反应，一些化合物会发生水解。 营养物质的受热破坏也可以看作一级反应： 分解速率常数Kd随物质种类和温度而不同（营养物质中维生素最容易被破坏，Kd最大），温度对Kd 的影响也遵循阿伦尼乌斯方程： 从上式可以做如下几点分析： （1）△E值可求 上式取对数得：ln K = - △E /RT + ln A 微生物的热死灭动力学 （2）K、△E、T三者之间的关系 K=f(△E、T) 一定温度下，对特定的菌体来说△E是定值，那么 在热灭菌过程中能控制的因素是什么： 温度 T 那么温度高一些灭菌好呢？还是温度低一些好 呢？ （这是要讨论解决的问题） 从式子ln K = - △E /RT + ln A来看，T升高，K增大 灭菌的目的：有效杀灭杂菌，同时尽可能降低对营养 的破坏程度。 对培养基进行灭菌，培养基中营养物质和微生物的△E 不同。 K增大的幅度还取决于△E 。