10生物科学分子生物学实验教案分析.doc

实验一 植物基因组DNA的提取及含量纯度检测目的意义 DNA是遗传信息的载体和基本遗传物质，它在遗传变异、代谢调控等方面起着重要作用，是分子生物学和基因工程研究的对象，但无论是研究植物DNA的结构和功能，还是开展外源DNA的转化、转导的研究，首先要做的就是从植物组织中提取天然状态的高分子量的纯化DNA。因此，本实验的目的是学习植物基因组DNA提取方法、原理和DNA的鉴定技术。 ? 植物基因组DNA的提取（CTAB法） 一、原理 植物组织中绝大部分是核DNA，它和组蛋白、非组蛋白结合在一起，以核蛋白（即染色质或染色体）的形式存在于细胞核内。CTAB(十六烷基三甲基溴化铵，hexadecyltrimethylammonium bromide，简称CTAB)：是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，它能与核酸形成复合物，在高盐溶液中(0.7mol/L NaCl)是可溶的，当降低溶液盐的浓度到一定程度(0.3mol/L NaCl)时从溶液中沉淀，通过离心就可将CTAB与核酸的复合物同蛋白、多糖类物质分开，然后将CTAB与核酸的复合物沉淀溶解于高盐溶液中，再加入乙醇使核酸沉淀，CTAB能溶解于乙醇中。 在DNA提取过程中必须始终注意以下几个关键问题： （1）DNA的二级结构和双链易受多种因素（如强酸、强碱、加热、低盐浓度、有机溶剂、酰胺类、尿素等）的影响引起双链解开，即“变性”，因此抽提时避免使用变性的条件。 （2）抑制内外源DNase的活力。DNase就象一把刀，它能把大分子的DNA切成碎片，所以要加以杜绝，现可以通过多种途径来做到这一点：a、低温操作；b、调节pH，使偏碱（pH8.0）；c、抽提液中加表面活性剂；d、加螯合剂（EDTA）除去酶的铺助因子（Mg2+），使酶活性丧失。 （3）防止化学降解。如过酸或过碱以及其它化学因素，会使DNA降解，一般综合考虑，取pH8.0左右为宜。 （4）防止物理因素降解。如温度太高或机械张力剪切等，DNA分子特别大，其分子量可达1012道尔顿，极易被机械张力拉断，甚至在细管中稍急一些的流动也会使DNA断裂，所以在抽提过程中要特别注意这一点，操作过程要尽量简便、温和、减少搅拌次数，也不要剧烈摇动。 （5）植物的次生代谢物（主要是胞质内的多酚类或色素类化合物）对核酸提取有干扰作用。因此，一般尽可能选幼嫩的、代谢旺盛的新生组织作为提取DNA的材料，这是因幼嫩的新生组织次生代谢物较少，DNA含量高，且易于破碎，植物材料最好是新鲜的。 分离提取植物DNA的方法很多，本实验采用CTAB法提取DNA并通过紫外吸收法和电泳鉴定。 ?二、实验材料、仪器及试剂 ?1、仪器 水浴锅：混匀器；高速冷冻离心机；移液器；紫外分光光度计；液氮罐；水平电泳槽；电泳仪 2、材料与药品 水稻幼苗 液氮：吸头、小指管；化钠；溴代十六烷基三甲胺(CTAB)；三羟甲基氨基甲烷(Tris)；8-羟基喹啉，氯仿；乙醇；RNA酶；蔗糖；溴酚蓝；异戊醇；β-巯基乙醇；盐酸(HCl)；异丙醇；乙二胺四乙酸(EDTA) 3、 ⑴ 2×CTAB提取缓冲液 Tris-HCl 100mmol/L ， pH8.0 NaCl 1.4mol/L EDTA 20mmol/L， pH8.0 CTAB (十六烷基三甲基溴化胺) 2% 上述溶液预先配好，用时需加入β-巯基乙醇0.1%-2% ⑵ 异丙醇 ⑶ Tris饱和酚 市售酚中含有醌等氧化物， 这些产物可引起磷酸二酯键的断裂及导致RNA和DNA的交联， 应在160℃用冷凝管进行重蒸。重蒸酚加入0.1％的8-羟基喹啉(作为抗氧化剂)，并用等体积的0.5mol/L Tris·Cl (pH8.0)和0.1mol/L Tris·Cl(pH8.0)缓冲液反复抽提使之饱和并使其pH值达到7.6以上，因为酸性条件下DNA会分配于有机相。 ⑷ 苯酚：氯仿：异戊醇（25：24：1） 按氯仿: 异戊醇＝24: 1体积比加入异戊醇。氯仿可使蛋白变性并有助于液相与有机相的分开，异戊醇则可起消除抽提过程中出现的泡沫。按体积/体积＝1:1混合上述饱和酚与氯仿即得苯酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）。酚和氯仿均有很强的腐蚀性，操作时应戴手套。 ⑷ TE缓冲液 10 mmo/L Tris·Cl (pH8.0) ，1 mmol/L EDTA (pH8.0)。高压灭菌后储存于4℃冰箱中。 ⑹ 70%乙醇(放-20冰箱中，用后即放回) RNA酶 将RNA酶溶于10mmol/L Tris·HC(pH7.5)、15mmol/L NaCl中，配成10mg/mL的浓度，于100加热15分钟，缓慢冷却至室温，保存于-20。