3.2++杂交技术.pptVIP

3.2 杂交技术 * 3.2.1 探针和探针标记 一、概念 1、探针（(probe）：带有能检测的标记物的DNA或RNA。 2、探针标记：使DNA或RNA带有可检测的标记物的过程。 互补的核苷酸序列通过Walson-Crick碱基配对形成稳定的杂合双链分子DNA分子的过程称为杂交。 3、杂交：互补的核苷酸序列通过碱基配对形成稳定的杂合双链分子DNA分子的过程。 注意：探针必须经过标记，以便示踪和检测。 二、标记方法 1、切口平移标记 2、随机引物标记 * 切口平移法(nick translation) 控制DNA酶浓度，使DNA的一条链在有限的位置上大开切口，形成3 -OH和5 -P末端。 E.coli DNA聚合酶Ⅰ将核苷酸连接到切口的3‘羟基末端。同时该酶具有从5’→3‘的核酸外切酶活性,能从切口的5’端除去核苷酸。由于在切去核苷酸的同时又在切口的3‘端补上核苷酸,从而使切口沿着DNA链移动, 用放射性核苷酸代替原先无放射性的核苷酸，即将一个个带有标记物的[α-32 P] dNTP加在3 -OH末端 。 最合适的切口平移片段一般为50-500个核苷酸。 切后平移：DNA的切口从左到右沿着DNA平移的过程。 * 2. 随机引物合成法 随机引物：能与任何DNA模板的多个位点配对互补的多个不均一序列寡聚核苷酸DNA片段。 随机引物合成双链探针是使寡核苷酸引物与DNA模板结合,在DNA聚合酶Klenow大片段的作用下,能在随机引物的引导下以带有标记物的dNTP为原料合成新的与模板DNA互补的探针。 通常产物平均长度为400-600个核苷酸。 * 利用随机引物进行反应的优点是： (1)Klenow片段没有5‘→3’外切酶活性,反应稳定,可以获得大量的有效探针。 (2)反应时对模板的要求不严格,用微量制备的质粒DNA模板也可进行反应。 (3)反应产物的比活性较高,可达4×109 cpm/μg探针。 (4)随机引物反应还可以在低熔点琼脂糖中直接进行。 * 3.2.2 杂交 blot一词，有不同翻译，有人叫“印迹法”，也有人翻译为“斑渍法”，更为普通的是直接称为Southern blot) * 一、种类 杂交技术有固相杂交和液相杂交之分。固相杂交技术目前较为常用，先将待测核酸结合到一定的固相支持物上，再与液相中的标记探针进行杂交。固相支持物常用硝酸纤维素膜(nitrocellulose filter membrane，简称NC膜)或尼龙膜(nylon membrane)。  * 固相杂交包括膜上印迹杂交和原位杂交。前者包括三个基本过程：第一，通过印迹技术将核酸片段转移到固相支持物上；第二，用标记探针与支持物上的核酸片段进行杂交；第三，杂交信号的检测。 * 二、杂交方法 　（一）、斑点印迹(Dot-blot)杂交 将待测核酸样品变性后直接点样在膜上，称之为斑点印迹。为使核酸牢固结合在膜上，通常还将点样后的膜进行80℃真空烘烤2h。  应用斑点印迹技术，可在一张膜上同时进行多个样品的检测，操作简便、快速，在临床诊断中应用较广。适合进行特定基因的定性及定量研究，但不能鉴定所测基因的分子量。  * （二）、Southern印迹(Southern blot) 1、定义：指将DNA片段经琼脂糖凝胶电泳分离后转移到固相支持物上的过程。 2、原理：将限制性内切酶对DNA样品进行酶切处理，经琼脂糖凝胶电泳将所得DNA片段按分子量大小分离，接着对凝胶进行变性处理，使双链DNA解离成单链，并将其转移到NC膜或其它固相支持物上，转移后各DNA片段的相对位置保持不变。用探针与经Southern印迹处理的DNA样品杂交，可鉴定待测DNA的大小、进行克隆基因的酶切图谱分析、基因组基因的定性及定量分析、基因突变分析及限制性片段长度多态性分析(RFLP)等。 3、作用：Southern杂交可用来检测经限制性内切酶切割后的DNA片段中是否存在与探针同源的序列。 * 4、Southern印迹的操作方法 （1）、毛细管转移(或虹吸印迹)。传统方法。 进行毛细管转移时，DNA片段由液流携带从凝胶转移到固相支持物表面。 安放装置时，在转移槽中央的平台上由下到上依次叠放变性凝胶、滤膜、一叠干的吸水纸巾；凝胶与转移缓冲液通过滤纸桥连接； 滤膜上的纸巾吸水产生并维持毛细管作用，液体由于毛细管作用抽吸通过凝胶，并将DNA片段携带聚集在滤膜上。 DNA片段的大小和琼脂的浓度决定了转移的速度。小片段DNA(＜1kb)在1小时内可从 0.7％琼脂糖凝胶上几乎定量转移，而大片段DNA的转移较慢且效率较低，如大于15kb的 DNA片段需要18小时而转移尚不完全。 * 500克总物 玻璃板 吸