李杨-实验方案讲义.docVIP

生防菌Y13的定殖与诱导油茶系统抗性研究 将Y13-GFP在LB培养液中培养至对数期离心收集菌体,生理盐水冲洗3次,用调节至菌体浓度为×109 cfu/mL。 1.2盆栽试验设计 选用两年生健康油茶苗，移栽于花盆中，15天后将10ml的Y13-GFP菌悬液均勾地加入到植株的根围,对照以清水代替菌悬液。接种后,分别于1d、3d、5d、7d、15d、30d、60d、90d、120d、150d、180d、210d、240d、270d、300d、330d、360d取根、根际土壤、叶片进行分析。 1.3标记菌株Y13-GFP的回收与检测 根际土壤：取样时,将油茶幼苗根系的土体土壤轻轻抖落,取根际土壤,按梯度稀释计数法待菌落长出以后在荧光显微镜下计发光菌落数。 根：用无菌水小心将油茶根系的土壤全部洗掉后,用75 %的酒精消毒3 min,再用2 %的NaClO消毒10 min,最后用无菌水漂洗6次。取最后一遍漂洗的无菌水涂于LB平板上以检测消毒是否完全。在无菌条件下,将消毒过的根系用研钵磨碎后,再在摇床上振荡10 min,梯度稀释涂布平板,每个处理重复3次,30 °C培养48 h,用荧光显微镜观察计算发光菌落数,测定其定殖情况。 叶：同1.3。 1.4数据处理 2 生防菌Y13诱导油茶对炭疽病的系统抗性研究 2.1生防菌Y13对油茶炭疽病菌在油茶叶面定殖的影响 2.1.1油茶叶片组织和炭疽病菌DNA的提取 2.1.2生防菌Y13菌悬液和病原菌孢子悬液的制备 将Y13接种到液体LB培养基中,30 °C,180 rpm/min培养16小时,将菌液常温下4500 rpm离心10分钟,倒去上清液,用无菌水悬浮菌体,将菌体浓度稀释到1xlO9cfu/mL, 用无菌水稀释至1xlO9cfu/mL。 油茶炭疽菌接种到PDA固体培养基上,置于30 °C培养箱培养4-5天后取出,用无菌水将平板上的分生孢子洗脱下来,后通过4层纱布滤去菌丝及部分固体培养基,将配制好的孢子悬液通过血球计数板计算孢子数量,并用无菌水配制成浓度为1xlO6cfu/mL的孢子悬液。 2.1.3生防菌Y13的处理以及病原菌的侵染 生防菌处理一：将制备好的Y13菌悬液接种到油茶的根部(10mL/株）。 生防菌处理二：将制备好的Y13菌悬液均匀喷雾至油茶的叶面(5mL/株）。 将处理后的油茶置于温室培养7d，将制备好的病原菌孢子悬液用移液枪加到油茶叶面上,每张叶面5个侵染位点,每个侵染位点滴加10 ul的孢子悬液,将处理后的植株转移到温室,100%的湿度,28 °C的侵染温度。 2.1.4病变组织及病变周围组织的采样 病变组织一般出现在侵染后的3-4天,因此选择4dpi,6dpi, 8dpi,10dpi和12dpi (dpi=侵染后天数)这5个时间点来釆样,从同一处理的3株植株的叶片,分别取病变组织,称取约1克的病变组织提取组织DNA。 病变周围组织的取样选取3dpi,5dpi, 7dpi, 9dpi和11dpi 5个时间点来采样。由于病变组织的大小随着侵染的时间不断增大,有必要设计2个模子,大小根据病斑的情况来确定，在3dpi, 5dpi的时间点用较小的模子来获得大小均一的组织叶片,7dpi,9dpi, 11dpi的时间点用较大的模子来获取组织样品。将获取的组织样品中病变组织小心的用小刀去掉,剩余的病变周围组织的样品称取1克提取组织 DNA。 2.1.5病原菌孢子的萌发实验 将病原菌孢子悬液稀释到1xlO3cfu/mL后,用移液枪吸取0.1mL均匀地涂布到玻片上,置于培养箱(100 %湿度,28 °C)进行萌发,分别取12,18,24, 30小时的样品在显微镜下观察孢子的萌发过程。 2.1.6病变组织及病变周围组织的DNA提取 采用 CTAB 方法提取样品基因组总DNA。 2.1.7实时荧光定量PCR 2.1.8病变组织大小的测量,分生孢子的分离以及附着胞在病变组织的观察 将接种炭疽菌的植株在温室培养2周后,首先用游标卡尺测量在不同处理叶面的病变组织的直径大小,然后转移至人工气候调节室3天后取出,从叶片中取1厘米见方的病变组织,至于10 ml的无菌水的离心管内,在涡旋仪上充分混和,吸取100 uL稀释涂布在PDA平板上,置于30 °C培养箱内,7-10天后统计菌落数。将不同处理的病变组织置于显微镜下观察附着胞的数量。 2.1.9数据分析 2.2生防菌Y13诱导油茶获得系统抗性研究 2.2.1生防菌Y13的处理以及病原菌的侵染 同2.1.3 2.2.2植物组织RNA的提取和cDNA旳合成 选取在炭疽菌侵染后的1,2,3天三个时间点取样,分别从接种病原菌的油茶叶片取1g进行样品制备。采用RNeasy@