利用荧光探针技术研究阿特拉津与黑土中微生物DNA的相互作用讲义.doc

阿特拉津与黑土微生物DNA的相互作用 摘要：利用荧光光谱和紫外吸收光谱技术，考察阿特拉津与东北寒地黑土中微生物DNA之间的相互作用，用溴化乙锭(EB)为荧光探针,通过对体系的荧光光谱、紫外吸收光谱、荧光抑制率以及Fo/F的测定，结果证明了阿特拉津对土壤微生物DNA-EB体系同时存在静电作用和嵌插作用两种方式，并可能改变土壤微生物DNA的空间结构，其荧光抑制率随阿特拉津浓度增高可达96%以上，说明阿特拉津与土壤微生物之间存在较强的作用力，可随浓度提高而提高。 关键词：阿特拉津；荧光探针；紫外吸收光谱；土壤微生物； 引言 三嗪类除草剂阿特拉津(Atrazine)，其化学名称为2-氯-4-乙氨基-6-异丙氨基-1, 3, 5-三嗪，在农业上使用较为广泛，是一种长效残留农药，被列为环境激素并具有“三致”作用，在土壤中不易降解，可随地表径流进入水体，造成农业污染。目前在东北黑土区，阿特拉津已成为重要农药污染物。 农药和微生物呈现相互作用，如果毒性太大，且常年具有累积作用，会影响土壤中微生物的分布，造成土壤板结，肥力下降[1]。近年来，农药与土壤微生物的生态关系成为污染生态学活跃的研究领域之一。姚斌（2005）等人研究了阿特拉津除草剂对土壤微生物生态特征的影响，研究发现10 mg/kg浓度的阿特拉津除草剂在处理初始阶段，能明显降低土壤微生物生物量碳和微生物生物量氮。[2]江雪飞（2009）经研究发现，在阿特拉津处理受试土壤15天后，细菌、放线菌数量均有所下降，土壤脱氢酶活性受到抑制。[3]这些说明阿特拉津对土壤微生物存在着毒害作用，能够抑制土壤微生物的生命活动，但目前该方面的研究只是针对土壤微生物的微生物量的研究，未能从内在阐释阿特拉津对土壤微生物的毒害作用机理。 有研究表明，许多化学物质都能够与DNA形成加合物，从而使生物体产生损伤。有报道阿特拉津可以与ct-DNA产生作用，[4]因此我们推测，土壤中的阿特拉津会与土壤微生物DNA作用，从而对土壤微生物造成损伤，抑制其生命代谢活动，进而影响其分布，并改变土壤性质，因此，研究阿特拉津与土壤中微生物DNA的相互作用，探明其毒理机理，对研究阿特拉津的农业污染具有重要意义。 利用光谱学方法研究分子之间的相互作用是毒理学上一种常用的重要手段，本文利用这一方法，首先从东北黑土区土壤中提取微生物离体DNA，然后对其与阿特拉津的相互作用进行研究，为阿特拉津的环境毒理学研究提供依据。 实验部分 1.1仪器和试剂 黑土样品取自哈尔滨市香坊农场。 阿特拉津,用丙酮溶解定容，操作液浓度1.0×10-3mol·L-1； pH 7.4的Tris-HC1缓冲溶液；TENC（DNA提取液，50mM Tris-HCl；20mM EDTA；100mMNaCl；1% CTAB）；蛋白酶K；20% SDS,氯仿-异戊醇（24:1）；异丙醇；乙醇；TE缓冲液；玻璃珠。实验用水为二次蒸馏水,实验中所用的其他试剂均为分析纯。 凝胶成像系统（伯乐）；TU-1800SPC紫外-可见分光光度计(普析通用公司)；F-4500荧光分光光度计(日本日立公司)。 1.2实验方法 1.2.1土壤中微生物总DNA的提取 为减少土壤腐殖质等杂物干扰，对ZHOU[3]所报道的土壤基因组提取方法进行了改进。具体提取方法为：将5 g土壤加入5 mLTENC，并加入25μL蛋白酶K,混匀后置于37℃摇床225r·min-1震荡30 min，然后加入1. 5 mL SDS后混匀，65℃水浴2 h(每隔10~20 min摇动1次)， 6 000 r·min-1离心15 min，转移上清液至新的离心管中；在原离心管中加入9 mL TENC及1 mL SDS，混匀后放入水浴中1 h，6 000 r·min-1离心15 min，取上清并，合并上次上清，加入等体积的氯仿/异戊醇，充分混匀后10 000 r·min-1离心15min，吸取上清至新离心管中，等体积加入异丙醇，混匀并放入冰箱中4℃过夜，10 000 r·min-1离心15 min，弃上清并加入2 mL预冷的70%乙醇洗涤2次，空气干燥后加入500 μL TE溶解。 在1%的琼脂糖凝胶中对获得的总DNA进行电泳，以检测是否得到较为完整的总DNA。用紫外分光光度计测定DNA的浓度与纯度。DNA浓度公式为： CDNA= 50 ×A260×稀释倍数（μg·mL-1） 1.2.2 光谱学实验 (1)在10mL比色管每管中加入：DNA最终浓度为2.5μl/mL，EB浓度1μg/mL，0.5mL pH=7.4的Tris-HCl缓冲液，加入不同浓度的阿特拉津，漩涡混合仪混匀。在λex=280 nm，λem=500~700 nm，发射及激发狭缝宽度均为5 nm，测其荧光光谱，并计算其荧光抑制率及F0/F的值。 (2)在2.5μl