罗汉果甜苷的分离方案讲义.doc

罗汉果甜苷IV和罗汉果甜苷V的检测和分离 前言： 根据毕设结果可知论文研究阶段采用的罗汉果为新鲜罗汉果，但在检测含量时并未检测到罗汉果IV的存在，可能原因有如下： （1）旋转蒸发过程中出现大量的泡沫，这是由于罗汉果甜苷对蛋白质有很高的起泡性，这一过程可能造成了罗汉果IV转化或者丢失； （2）由于罗汉果甜苷IV的含量极低，可能是由于检测器不灵敏造成无法检测到含量； （3）检测方法、流动相的比例、选择、检测波长不对，有文献表明采用C18柱，当乙腈的含量为24%，检测波长为210nm时能很好的检测到罗汉果IV的含量； （4）大孔树脂的选型问题，都不能很好的吸附到罗汉果IV； （5）实验操作不规范导致提取率极低； （6）可能是采集来的罗汉果存储时间过长，或保存方法不当导致罗汉果IV已经发生了转变； 针对以上失败原因分析现整理出新的罗汉果甜苷IV和罗汉果甜苷V的检测和分离的方案如下： 1 选果 采用坐果大概30天的新鲜罗汉果，有实验研究表明此时罗汉果甜苷V的含量最高。 2 提取以及去除杂质 （1）提取方法：采用微波提取 （2）出去杂质多糖、纤维素、果胶 进行水提醇沉（将粗提取液进行浓缩，加乙醇，是乙醇的最终浓度控制在70%以上，多糖、纤维素、果胶等都不溶于高浓度的乙醇溶液）。 （3）去除纤维等 将醇沉后的过滤液过半透膜，以去除纤维素等杂质。（淀粉、纤维素的分子直径都在1~100nm之间，属于胶体的范畴，不能透过半透膜。 可以加水后，用半透膜渗析除去） 。 去除酯类 用石油醚进行萃取。 3 过柱 树脂型号的选择 采用大孔树脂吸附，可供采用的树脂型号AB—8、D201、HPD100、HPD722。 4 分离 洗脱液的选择： （1）首先用20%乙醇进行洗脱，20%乙醇冲洗都能很好地在除去蛋白和多糖。 （2）洗脱液可以选择浓度分别为40%、65%、90%的乙醇、甲醇、丙酮、乙腈等，对洗脱剂进行逐一的实验探索。（由于制粉的过程也是可能导致罗汉果甜苷IV丢失的一个原因，所以可以直接取过柱液拿去用高效液相进行测定含量，方法见下文。或者采用薄层层析法，定性的判定罗汉果甜苷IV和甜苷V的量。展开剂为24%的乙腈水溶液） 5 高效液相色谱法测定含量 采用C18柱，乙腈的含量为24%，流速0.8min/min，检测波长为210nm。 6 罗汉果甜苷IV和甜苷V的分离和制备 （1）直接采用制备型的高效液相 （2）硅胶柱层析分离，以24%的乙腈水溶液或者三氟乙酸—水溶液为展开剂。 （3）加入纤维素酶，探究其对罗汉果甜苷IV以及甜苷V含量的影响。 附录 水提醇沉（转） (2009-06-16 13:45:27) 转载▼ 标签： 校园 关于醇沉的知识整理如下： 水提醇沉淀法（水醇法）：先以水为溶媒提取药材有效成分，再用乙醇沉淀除去杂质的方法。利用水、乙醇对有效成分和无效成分溶解度的不同使之分离精制。 (一) 工艺依据：通常含醇量 50~60%时淀粉、多糖沉淀。60%或70%以上，除鞣质、树脂外，大部分被除掉。 (二) 操作 中药，加水煎2~3次，过滤，滤液浓缩至1：1~1：2（ml：g）或相对密度1.08-1.15， 加适量乙醇，使含醇量达一定要求（50~60%，60~70%）冷藏（10~48小时），滤过。 (三) 影响因素 1.醇沉浓度的选择 一般45%醇沉可去淀粉、糊精等无效成分，50%醇沉后制颗粒、片、胶囊较多；60~70%醇沉制合剂、口服液，澄清度好。50~60%、70~80%二次醇沉多用在注射液、滴眼液等，而60~80%的沉淀经丙酮等洗涤后，可得多糖。 2.所用乙醇浓度的选择 根据经验，乙醇的浓度与药液需要达到的乙醇浓度之间差20%～25%最佳。浓度太低，乙醇用量大浪费，回收不方便，且沉淀成絮状，难以下沉，效果差；浓度太高，得到的醇提液较少，沉淀中含有大量的有效物质，且加入高浓度乙醇，易造成局部浓度过高，形成大块沉淀，将有效成分包裹，随沉淀除去。 3.药液浓度 药液浓缩后的相对密度如果太小，由于药液比较稀，形成的沉淀不易聚结，难以下沉，且浪费乙醇；如相对密度太大，药液因长时间煎煮浓缩，易使苷类、萜类、维生素等成分破坏，且造成淀粉糊化，醇沉时形成大块，包裹有效成分。 4.药液温度 药液温度高，遇冷的乙醇后，骤冷易聚结成团状沉淀，且沉淀增长很快，防碍了有效物质的提出，故效果不理想；药液温度低，相对难以导致沉淀聚结，效果最佳。一般浓缩后放冷至室温。 5.加醇方式 加醇应采用慢加快搅的方法，以使加入的乙醇迅速分散，避免局部浓度过高，形成大块沉淀。且应按一个方向搅动，以免使药液乳化，不易使沉淀下沉分层。如用来醇沉的乙醇浓度不等，应