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生化分析技术  第一编 概述 概论 生化研究技术： 从生物材料中分离、纯化生物分子，并对各成分进行检测的一门科学。 研究内容： 生化分离制备、生化分离分析。 生化技术特点： 材料组成非常复杂 目标成分在材料中含量极微 生物物质的活性易遭到破坏，需要选择适宜条件 影响因素很多，实验方法经验性强生命大分子物质的制备 生命大分子：通常指动物、植物和微生物在进行生长发育、新陈代谢时所形成的蛋白质（包括酶）和核酸等有机化合物的总称。 生命大分子物质制备的基本流程： 材料的选择与处理→测力方法的确定→细胞破碎→抽提→浓缩→纯化方案的设计与评价→有效成分纯度和性质的分析及包装 材料的选择与处理 材料的选择 有效成分：是指欲纯化的某种单一的生命大分子物质。 杂质：有效成分以外的其他物质。 材料选择遵循的原则： 有效成分含量多、稳定性好 来源丰富、保持新鲜 提取容易、工艺简单 杂质有综合利用价值 材料的处理 动物脏器： 冰冻——最常用的处理方法 从刚宰杀的动物中得到的脏器，若不马上抽提、纯化时，应及时移至-10℃冰库（可短时间保存），或-70℃低温冰箱（数月不变质）贮存。 干燥——制成丙酮粉 脱脂 方法： 人工剥去脏器外的脂肪组织 浸泡在脂溶性的有机溶剂（如丙酮、乙醚）中脱脂 采用快速加热（50℃左右）、快速冷却的方法，使熔化的油滴冷却后凝聚成油块而除去 利用油脂分离器使油脂与水溶液得以分离 植物组织： 若是叶片，需用清水洗净方可使用，或置-30~-4℃冰箱贮藏，可在10h内使用。 若是种子，则需要泡涨或粉碎后才可以使用。（若种子中含油脂较多时，也要进行脱脂处理） 微生物： 若要收集胞外酶或某些辅基，则用接种于适当的培养液培养一段时间后，用离心法收集到的上清液即可。（可置低温下短时间贮存） 若要收集胞内酶，则用收集到的菌体经破碎细胞后提取其有效成分。（可制成冻干粉，在4℃保存） 测定方法的确立 目的与要求 目的：跟踪检测有效成分。 要求：专一、灵敏和简便快速的测定方法 常用的测定方法 光谱法——使用最多的一种方法 包括：紫外光谱法（测定核酸含量、测定蛋白质的含量及纯度）、可见光光谱法、荧光光谱法、浊度法 电化学法 有些化学反应过程放出质子氢（H+），可用灵敏的PH计或NaOH溶液滴定等方法追踪其变化，从而计算出欲测物的含量或活性。 生物活性检测法——专一性强但速度慢 免疫分析法——灵敏度高、专一性强 采用抗原与抗体之间发生的特异性反应。 生物传感器 可通过显示器反应出有效成分的数量。 细胞破碎 机械破碎 研磨法 原理：利用机械作用力 用研磨棒研碎，如在研钵中加入一定量的石英砂（45~50μm）可提高研磨效果。也可用匀浆器处理，此法较温和，适宜实验室应用。若是大规模生产则用电动研磨法。 组织捣碎器法 原理：利用机械作用力 这是一种剧烈的破碎细胞的方法。捣碎器（8000~10000r/min）处理30~45s。（动植物细胞皆可，若为酵母或细菌细胞时，需加石英砂才有效。）在捣碎期间，必须保持低温，以防止操作过程温度升高引起有效成分变性，捣碎时间也不易太长。 超声波法 原理：利用超声波来破碎细胞（20kHz40kHz）。常用于处理菌体细胞 为防止电器长时间运转产生过多的热量，常采用间歇处理和降低温度(冰浴)的方法进行。（噪声用隔音箱处理） 冻融法 将细胞置低温下冰冻一定时间后，取出置室温（或40℃左右）迅速融化。如此反复冻融多次，细胞可在形成冰粒和增高剩余胞液盐浓度的同时，发生溶胀、破碎。 压榨法 原理：在高压下使细胞快速通过小孔，并撞击在撞击环上，压力突然降低的剪切力及撞击的剪切力使细胞破碎。 溶胀和自溶(渗透压冲击法:是一种较温和的处理方法) 溶胀：在低渗溶液如低浓度的稀盐溶液中，由于存在渗透压差，溶剂分子连续大量进入细胞，引起细胞膜发生胀破的现象。 自溶：细胞结构在本身所固有的各种水解酶（如蛋白酶和酯酶等）的作用下，发生破裂、溶解的现象。 化学处理 用脂溶性的溶剂（如丙酮、氯仿、甲苯）或表面活性剂（如十二烷基磺酸钠或十二烷基硫酸钠）处理细胞壁、细胞膜的结构部分溶解，进而使细胞释放出各种蛋白质类或DNA等物质，并导致整个细胞破碎。 生物酶降解 生物酶（如溶菌酶）有降解细菌细胞壁的功能。 抽提 抽提的含义 抽提：通常是指用适当的溶液（如缓冲液、稀酸、稀碱或有机溶剂（如丙酮、乙醇））进行反复萃取，逐步将原料中有效成分最大限度分离出来的过程。 抽提液应具备的条件： 对有效成分溶解度大、破坏作用小 对杂质不溶解或溶解度很小 来源广泛、价格低廉、操作安全 抽提有效成分的影响因子 PH 由于生物大分子存在等电点PI，所以，选择溶液应偏离其PI并稳定存在的PH范围，杂质溶解度最小。 抽提碱性蛋白质选用低PH的溶液；抽提酸性蛋白质选用高PH的