基础生化实验-蛋白质纯化解说.doc

蛋白质纯化 一、目的: 利用金属亲和性管柱(metal affinity column)来大量纯化带有affinity tag的基因重组蛋白。 二、原理: 由于六个Histidine 所组成的His Tag (metal affinity tag)可与Ni2+ bind，所以利用基因重组技术在表现的蛋白质加上His Tag，再以金属亲和性管柱(Ni-NTA) (此His- tag序列可与带二价正电的阳离子相螯和)及liquid chromatography来大量纯化蛋白质。 三、试剂与器材: 1.loading(binding) buffer (10mM imidazole,0.3M NaCl,50Mm Tris-HCl Ph7) 细菌回溶成为蛋白质的载体以保持活性 2.wash buffer (20mM imidazole,0.3M NaCl,50Mm Tris-HCl,Ph7) 3.elution buffer (20mM EDTA,0.3M NaCl,50Mm Tris-HCl,Ph7) 上课补充: 蛋白质很脆弱，需要在特殊的buffer里。 四、仪器与设备: FPLC(速液相色谱仪) 五、步骤: 1.将管柱架在铁架上，把亲和性胶体悬浮装填于管柱内。 2.以2~3倍CV loading buffer清洗管柱后，注入蛋白质样本。 3.以wash buffer梳洗，2到3倍column体积。 4.用wash buffer和elution buffer进行线性梳洗，并收集流出液体，以 FPLC UV monitor上的OD280数据读取样品流出与否，并观察冲离液之曲 线图。 上课补充: 胞内型分泌需要用超音波破菌，因为会放热所以要放在冰中使用。 线性梳洗为加入elution buffer会有颜色变化会把镍离子跟imidazole冲洗掉，剩下胶体溶液。 其中imidazole和Histidine类似也会和镍离子结合所以会竞争，可拿来洗涤蛋白质。(可详见问题一及补充资料2) 六、问题: 问题一: Imidazole的结构与特性。 Imidazole又名咪唑即1,3-二氮唑，是一个五元杂环芳香性有机化合物，化学式C3H4N2。它也是一个生物碱。白色或浅黄色固体结晶，可溶于水、氯仿、醇、醚，具有酸性，也具有碱性。氢原子在两个氮原子之间移动，因此存在两个互变异构体。 咪唑环结构在生物分子中广泛存在，例如组氨酸和对应的荷尔蒙组胺。很多药物也包含有咪唑环，例如硝基咪唑和咪唑类抗真菌药物。 咪唑 英文名 Imidazole IUPAC英文名 1,3-diazole IUPAC中文名 1,3-二唑 别名 间二氮茂、咁恶啉 识别 CAS号 288-32-4 RTECS号 N13325 1985-86 性质 化学式 C3H4N2 摩尔质量 68.08 g mol?1 外观 白色或浅黄色固体 密度 1.23 g/cm3 熔点 89-91 °C (362-364 K) 沸点 256 °C (529 K) 在水中的溶解度 易溶 pKa 14.5 pKb 6.95 结构 晶体结构 单斜 分子构型 平面五元环 结构与性质 咪唑为平面五元环状化合物，易溶于水（以无限比例）和其它极性溶剂。咪唑的两个氮原子间存在永久偶极，极性很强，偶极矩为3.61D，并且分子间存在氢键缔合，导致了咪唑具有反常高的沸点（256°C）。分子中存在一个6电子共轭大π键，故具有典型的芳香性。与氢以σ键相连的氮原子提供一对电子，环内其余四个原子各提供一个电子成键。 1N上有氢的咪唑环中，氢原子可以在两个氮原子间迁移，存在两个互变异构体，C-4和C-5是等同的。这两个互变异构体无法分离，当有取代基时，常以「4(5)-取代咪唑」（如4(5)-甲基咪唑）来命名。 组氨酸生成组胺的反应如下所示： 咪唑一个用途是在金属螯合亲和层析(IMAC)中用于His标签蛋白的纯化。标签蛋白与层析柱表面珠孔内的镍离子介质发生结合，过量的咪唑通过层析柱，将与镍配位的标签蛋白洗脱下来，得到高纯度的目标蛋白。 咪唑是许多药品的重要组成部分。许多杀菌剂和抗真菌、抗原虫和抗高血压的药物中含有合成咪唑。咪唑是茶叶和咖啡豆中含有的茶碱分子的组成部分，具有刺激中枢神经系统的作用。通过干扰DNA的活动抑制白血病的抗癌药物巯嘌呤中也含有咪唑。 问题二: 2.ETDA的资料(整理) EDTA又名乙二胺四乙酸(Ethylene Diamine Tetraacetic Acid) 简称：EDTA简称：EDTA 俗名；依地酸（特别是它的