手性色谱教案分析.doc

1 手性高效液相色谱法 *手性药物分析的概念 *常用手性高效液相色谱法 手性衍生化试剂法 手性固定相法 手性流动相添加法  2 手性的概念：一种镜像反射的对称性 3 手性分子：组成相同但空间结构上互成镜像的分子，称之为对映异构体。 分子结构中含有不对称碳原子是最常见的手性结构。 根据对偏振光的作用不同可分为R、S体，两者的等量混合物称之为消旋体。 4 手性异构体在药理学效应上的差异 Pfeiffer规则： 对映异构体之间的生物活性存在着差异； 不同的对映体之间活性的差异是不同的； 当手性药物的有效剂量越低，即药效强度越高时，则对映体之间的药理作用的差别越大。 外消旋体和其两种单一对映体是不同的3种实体！ 5 对映体与生物大分子的三点作用 手性分子的a、b、c三个基团与受体分子的活性作用点?、?、? 结合，是高活性对映体（优映体）。 手性分子的a、b、c三个基团中只有a和b与受体分子的活性作用点?和?结合，是低活性对映体（劣映体）。 6 在未研究清楚两种单一对映体之间的生物学差异时，以消旋体给药往往会影响药物质量，甚至会严重损害人体健康。 “反应停”(Thalidomide)作为人工合成药，当时投入使用时是两种对映体的混合物。 7 反应停：五十年恩怨 发展趋势：劣映体本身或其代谢物产生毒副作用，不再使用外消旋体。外消旋体转换成单一对映体，不仅提高质量，还延长药物寿命。 如：氧氟沙星的左旋异构体活性更强，左旋氧氟沙星临床使用剂量是消旋体的一半。 10 手性拆分（Chiral resolution） 对映体除了偏振光的偏转方向不同外，其它理化性质完全相同，因而分离难度大。 手性色谱拆分方法：创造（或引入）手性环境，构造非对映异构体，使药物对映体间呈现理化特性的差异，从而实现药物对映体的色谱分离。 . 11 组成相同但空间结构上互成镜像的分子，称之为对映异构体；不成镜像的分子，称之为非对映异构体，分子中所含手性碳越多，非对映异构体的数目越多. 非对映异构体 （ - ）盐酸伪麻黄 （-）麻黄碱 （+）麻黄碱 （ + ）伪麻黄碱 （ - ）伪麻黄碱 13 色谱条件：色谱柱：苯基柱150mm×4.6mm，I.D. 5mm；流动相：三乙胺-水（含50mmol·L-1磷酸二氢钾，磷酸调pH至 4.0）-甲醇（0.01∶90∶10, v/v/v）；流速1.0 mL·min-1；检测波长：210nm；柱温：室温。 14 手性高效液相色谱法（Chiral HPLC) 手性衍生化试剂法（CDR）（分析物） 手性固定相法（CSP） （固定相） 手性流动相添加法（CMP）（流动相） 15 手性试剂衍生化法（CDR） 原理： 光学活性药物与有高光学纯度的手性试剂于分离前衍生化，在药物对映体中引入另外一个手性，形成非对映异构体，再以HPLC分析。 16 手性反应注意事项 手性试剂为高光学纯度试剂，光学稳定性好： 手性待测物必须具备反应活性基团，如胺基（-NH2），醇基（-OH），羧基（-COOH），以保证与CDR反应完全 ； 生成的非对映体光学稳定，柱效要高，能有效检测。 17 胺类对映异构体 异硫氰酸酯（ITC） 常用试剂有苯乙基异氰酸酯（PEIC）、2,3,4,6-四-O-乙酰基-β-D-吡喃葡萄糖异硫氰酸酯（GITC） 。 广泛应用于氨基酸及其衍生物、麻黄碱类、肾上腺素类、肾上腺素拮抗剂、儿茶胺类等药物的分离分析。 18 GITC衍生化分离胺类对映异构体 反应原理 在三乙胺存在条件下进行，于乙腈、二氯甲烷或DMF中进行。 19 色谱分离和前处理条件优化 流动相组成和流动相pH对拆分的影响 （1）降低甲醇含量改善分离度，保留时间增加； （2）未衍生化的羧酸基对pH值比较敏感。 衍生化时间及GITC用量的优化 （1）反应时间：10 min ~ 30 min （2）用量：过量两倍 20 手性拆分结果 色谱条件： C18色谱柱，流动相：甲醇∶1%三乙基乙二氨四乙酸（TEAA 缓冲）（pH = 5.5），检测波长254 nm； 1 ml