TNFα、mm-LDL与AngⅡ对ECV304细胞PDGF-B链基因转录调控的影响.pdf

细胞PDGF．B链基因转录增强，资料更少。本实验从基因转录水平分别探讨 TNF 平的影响：2)含人PDGF-B链基因不同上游序列荧光素酶报告基因质粒的构 建；3)5’上游序列对TNF 转录的调控作用。 首先，本实验以GAPDH为内参照，采用反转录-多聚酶链反应(RT—PCR)方 mm-LDL及200U／ml 法分别检测10～mol／L TNFⅡ作用于 AngII、100ttg／ml 倍、2．0倍和1-3倍，提示TNF PDGF—B链基因的表达有促进作用。 随后，构建一系列含人PDGF．B链基因不同上游序列的荧光素酶报告基因 质粒，以探讨TNF 调控作用。先用PCR方法分别扩增出人PDGF．B链基因上游调控序列．1352bp～ Basic载体中，最后构建成功的重组荧光素酶报告基因质粒主要 向克隆至Op(3L-3 等。 将上述报告基因质粒分别与内参照质粒pSV—B-gal共转染培养的ECV304细 胞，观察10。6mol／L nllrl·LDL作用2小时和18d,时后荧光素酶的 AnglI或100I，tg／ml 表达活性。结果显示： pSIS-82／+43Luc的细胞荧光素酶表达量较对照组都有一定程度增加，但与对照 -2- 中国协水I医科大学坝士论文 pSIS一190／+43Luc的细胞荧光素酶表达量较对照组明显增加，分别为对照组的 明显减少，与对照组无明显差别。以上结果提示2小时的作用时间可能稍短， 表达，该作用主要依赖上游序列一190／-83bp的存在，即对Angll诱导起反应的顺 式调控元件可能存在于．190A83bp范围内。 细胞荧光素酶表达量也有所增加，为对照组的1．27倍，但差异无显著性：而转 染pSIS一82／+43Luc质粒的细胞，荧光素酶表达量较前两组显著降低，并与对照 组无明显差异。lrffp_-LDL处理转染内皮细胞18小时的结果同前。以上结果提示 的存在，即对mm-LDL诱导起反应的顺式调控元件可能存在于．1352／．190bp范围 内。 观察TNF a对5’上游序列调控ECV304细胞PGDF．B链基因转录的影响，采 TNF pSIS一189／+43Luc和pSIS一84／+43Luc，用200U／ml Q处理18小时后，转染 组增高：当转染质粒仅含上游序列一84／+43bplj寸，荧光素酶表达量显著降低。提 示TNF a促进ECV304 PGDF．B链基因表达依赖上游．85bp以远的序列。 综上所述，在观察到TNF PGDF—B链基NmRNA表达的基础上，本实验构建了一系列含人PGDF．B链基因 不同上游序列的荧光素酶报告基因质粒，并初步揭示了人PGDF．B链基因上 TNF a、rrffrl—LDL和AnglI的诱导反应元件可能分别定位于该基因上游序列 一1758／-85bp、13521—190bp和-190／一83bp区域内。＼0 ， 止～一一7＼一／／ ．． !里坠塑垦型查兰堡生堡苎——．—— ABSTRACT of lethal a cause diseases．However，its Atherosclerosis(AS)isprincipal many has asa havenot