利用酵母三杂交系统筛选人胚海马cDNA文库以获得能够FMRP发生相互作用的mRNAs.pdf

!望垫塑垦型查兰堕主笙壅 合体中的mRNAs一直处于无活性状态，直到突触的信号输入改变FMRP的活性，从 些靶mRNAs的翻译异常，从而导致一系列的临床病理表现。筛查并研究FMRP的靶 热点。 Brown实验室利用免疫共沉淀和微阵列分析的方法从鼠脑抽提物中确定了数百 在哺乳动物细胞系内发现了一系列的靶基因【69】。这两组筛查结果仅有部分相同，说明 筛查方法和研究对象的差异会对筛查结果造成很大的影响。而目前所进行的筛查实验 几乎都是利用体外(invitro)筛查的方法，且研究对象大多是实验动物或哺乳动物细 胞，与人体内的实际情况有较大的差异，难免会遗漏一些可能很重要的相互作用信息。 二研究目的 酵母三杂交系统是一种在酵母双杂交系统基础上发展而来的，可以快速检测 RNA．蛋白质相互作用的体内(invivo)筛查体系。它可以更加准确、更加生动地动 AF040097 态反映真核细胞内的相互作用情况。已有人利用该系统对FMRP与靶KNA 和AF040099的相互作用进行过研究167]，但是将该系统应用于大规模的筛查工作尚未 见报道。 我们希望利用酵母三杂交系统对人胎脑海马eDNA文库进行大规模的筛查，确定 在该体内(in 筛查结果将是一种有益的补充，并有可能筛选出新的有意义的相关致病基因。 三实验方法与实验结果 mRNA，逆转 本课题以19周胎龄的人胎脑海马总RNA为材料，分离得到l Itg 录合成平末端双链cDNA，琼脂糖凝胶电泳显示cDNA片段大小介于50Kb之 bp--3 !里堡翌堡型查堂生主丝奎 间，绝大部分集中于200bp～lKb。采用滤膜截留的方法回收100bp以上的cDNA 片段，用于构建eDNA质粒文库。限制性内切酶Sma I消化RNA表达质粒pRH5’， 琼脂糖凝胶电泳回收线性化载体DNA后再进行碱性磷酸酶去磷酸化处理，纯化回收 Ill 线性化质粒载体构建酵母三杂交的cDNA质粒文库。每200 ng线性化pRH5’质粒载 体与大约200cDNA片段进行一次连接反应并转化大肠杆菌感受态细胞，在lO个 ng 150Into 连接转化效率2×105／嵋。随机挑取培养平板上的克隆进行菌落PCR，有效克隆比例 95％，插入片段长度介于约100Kb之间。该连接转化反应共进行了10次，从 b旷2 即制得酵母三杂交的cDNA质粒文库。 5’一3’)对上述cDNA文库进行筛查。在第一轮筛查 蛋白的表达载体pYESTrp3／FMRI mi)选择性固体培养基平板上的超 工作中共对120块SD／Trp．／His-／Um-／Zeo／3．AT(30 过100万个酵母克隆进行了B．半乳糖苷酶活性检测(ColonyLiftAssay)，共得到122 个阳性酵母克隆。分别提取阳性酵母克隆的质粒并转化大肠杆菌细胞，利用针对目的 些质粒的外源eDNA插入片段进行双向序列测定，并对插入片段的核酸序列进行 blastn(NcBI)比对分析，排除重复的序列，共得到50种不同的靶基因信息。 由于酵母杂交系统难以避免的假阳性效应，并且在某些阳性酵母克隆中会同时存 在2种甚至2种以上的目的RNA表达质粒，必须确定是哪一种或是哪几种目的RNA 与FMRP发生了相互作用，所以我们再将上述50种可能的靶基因所对应的