克隆文库与系统发育重点分析.pptVIP

克隆文库构建与系统发育分析 刘晶静 2010-5-21 常用分子生物学技术 16S rDNA 克隆文库 构建16S rDNA 克隆文库是微生物分子生态学中用来调查环境中原核微生物组成的常用方法之一 (Microbiol Rev, 1995) 突破了用传统的微生物分离纯化的方法调查环境中微生物多样性时很多微生物无法得到纯培养的限制 广泛运用于土壤、海洋、湖泊、肠道等多种生态系统中微生物多样性的调查(FEMS Microbiol Ecol, 2004) 核糖体RNA 是蛋白质合成必需的，所以它们广泛存在于所有的原核生物中，并且结构和功能都是保守的； 16S rDNA的序列中包括可变区和高变区，因此既可以利用保守区域来设计引物，又可以利用高变区来进行序列间的比对； 它们的序列变化比较缓慢而且在原核生物中不发生水平转移，因此16S rDNA 之间序列的差异可以反映不同生物之间的进化关系 (Annu Rev Microbiol, 1986)。 通过研究基因组中的“biomarker”来研究环境中微生物的多样性的 GenBank / RDPⅡ Ribosomal Database Project Ⅱ /html/ 1. PCR扩增 引物选择 消除artifact chimeria（嵌合体）共扩增造成的嵌合体 heteroduplex（异源双链）序列相近的模板之间退火机率减小 PCR 的偏好性扩增 为减少PCR 的循环数和模板浓度，提高延伸时间以及选择适当的DNA 聚合酶有利于减少artifact。(Appl Environ Microbiol, 2001) 减少PCR 循环数有利于减少PCR偏好性扩增。(FEMS Microbiol Rev, 1997) DNA纯化试剂盒/ 胶回收试剂盒 Agrose凝胶电泳验证 粘性末端之间的PCR 产物连接。 载体具有的氨苄青霉素抗性，所使用的宿主菌DH5α 没有该抗性基因，因此只有带有该质粒的克隆才能在含有氨苄青霉素的平板上生成。 感受态细胞中加入连接产物进行转化； 抗生素抗性筛选（转化菌液均匀地涂布于含 Amp、X-gal、IPTG 的LB平板上，37℃倒置培养过夜，挑选白色菌落进行鉴定。） 过PCR 的方法检查插入片度的大小是否正确 载体上插入有16S rDNA 序列的阳性克隆 载体引物 为了减少测序的数量，可以先分别用两种不同的核酸内切酶分别对文库进行分型 Amplified Ribosomal DNA Restriction Analysis Restriction Fragment Length Polymorphism 测序反应 按序列相似性大于97%（97%-100%都可以）的标准，把所有的测序结果分成若干个OTU（operational taxonomic unit）。然后用每个OTU 的代表序列在GenBank 和RDPⅡ数据库中进行比对，就可以找到这些OTU 相应微生物的系统发育地位，这样就可以知道环境中微生物的组成情况 16S rDNA 克隆文库的库容（library size） Rarefaction curve Coverage C Species richness Shannon Index Simpson Index 序列处理软件：Sequnecher BLAST比对 Clustal X BioEdit 建树软件：MEGA/PAUP/PHYLIP 系统发育学研究的是进化关系；系统发育分析就是要推断或者评估这些进化关系。 序列比对是构建系统发育树、进行系统发育分析的前提和必要条件，目的是建立起所检测序列与其他序列的同源关系, 提取系统发育分析数据集 系统发育树是表达分类群之间系统发育关系的一种树状图, 它可以推测生物类群系统发育的分支样式, 给出分支层次或拓扑图形, 并能估算类群之间遗传关系的远近。在生物进化研究中, 通过构建系统发育树, 可以推断个体之间以及群体间的亲缘关系, 以及研究对象在系统树中所处的进化地位等。 比对 建立取代模型 建立进化树 进化树评估 先进行序列比对；再利用比对的结构用合适的算法求出遗传距离；最后再根据遗传距离构建发育树 通过系统发育分析所推断出来的进化关系一般用分枝图表（进化树）来描述，这个进化树就描述了同一谱系的进化关系。 距离法（Neighbor joining, NJ） 数据组中所有序列两两对比的结果 在系统发育树构建中应用最为广泛, 它基于最小进化原理, 可以较快的构建系统树, 同时也比较适合于分析较大的数据集, 并可以很快地进行自展检验。 最大简约法（maximum parsimony, MP） 多重比对的结果 当序列分歧度较低时,无需模型,