DNA提取实验方案.docVIP

脱腐 10ml离心管中加入0.5g沉积物（干重）和5ml脱腐缓冲液[100mmol/L Tris-HCl,PH10.0,50mmol/L Na2EDTA,200mmol/L NaCl,100mmol/L Na4P2O7,1%(质量浓度)PVP,0.05%（质量浓度） TritonX-100]，漩涡混合3min，60℃水浴5min，3000×g离心3min。根据上清颜色与洗涤缓冲液颜色无明显差异。（土壤与沉积环境样品腐殖酸脱除新方略，席峰） 10ml离心管中加入0.5g沉积物（干重）和5ml PBS buffer(8g NaCl，0．2g KC1，1．44g Na2HPO4，0．24g KH2PO4，溶于1L水中，pH=7．4) 旋涡混合3min, 60℃水浴5min, 3000×g离心3min。根据上清颜色再重复洗涤与离心1-2次，至上清颜色与洗涤缓冲液颜色无明显差异。（从颗粒污泥中提取DNA的几种不同方法比较，陈竹） 裂解与提取 1. 冻融+玻璃珠+溶菌酶+SDS法（可用于微生物群落分子生态学研究的活性污泥总DNA 提取方法研究，高平平） 1) 置0.5g沉积物（干重）于10ml 的灭菌离心管中离心5m in( 8000×g, 4℃) , 弃上清, 沉淀(约100mg) 悬浮于5ml无菌水中。向管内加入0.35g灭菌玻璃珠(直径2～3mm) , 将离心管管盖拧紧后置于旋涡混合器击打15min, 离心8min (8000×g, 4℃),弃上清,沉淀用于细胞裂解。 2） 向沉淀中加入0.5ml灭菌的TENP缓冲液(50mmol/L Tris-base,20mmol/L EDTA , 100mmol/L NaCl, 0.01g/ml 聚乙烯吡咯烷酮, pH10) , 悬浮后将菌液在液氮中冷冻3min, 沸水煮2min, 重复3次后进行菌体离心(10min, 12000×g, 4℃)。上清液快速置于冰上留用, 沉淀用于进一步裂解。 3） 将沉淀悬浮在1.5ml的溶菌酶溶液中(0.15mol/L NaCl, 0.1mol/L Na2EDTA , 15mg/ml溶菌酶, pH 8) , 其中溶菌酶配制成30mg/ml的母液, -20℃保存备用。37℃温浴1h后, 向菌液中加入1.5ml 10%SDS 溶液(0.1mol/L NaCl, 0.15mol/L Tris-HCl, 10% SDS, pH 8) , 上下摇匀,待菌液变清后离心10min (12000×g, 4℃) , 取上清置于冰上留用。 4） 收集两步的DNA上清液(3～3.5ml) ,用等体积的Tris-饱和酚抽提2次、酚+氯仿和氯仿各抽提1 次。用40ul的3mol/L乙酸铵和3ml无水乙醇沉淀DNA ,-20℃放置30min后离心(20m in, 14000×g, 4℃)。用1ml的70%乙醇洗涤沉淀,离心10min (10000×g, 4℃)。DNA沉淀真空干燥后,溶于50ul 超纯水中, 加RnaseA 3ul (10mg/ml) , 37℃温浴15～20min 消化RNA , 样品在-20℃保存备用。 2. CTAB+溶菌酶+SDS法 称取0.5g干沉积物，置于灭菌的10mL离心管中 向离心管中加入1.35mL DNA裂解液（100mmol/L Tris-HCl，20mmol/L EDTA，1.4mol/L NaCl，1%CTAB，pH8.0，121℃高温灭菌），充分混匀，再加入溶菌酶50uL（100mg/ml），混匀，37℃温育30min；然后加入5uL蛋白酶K（20mg/mL），混匀后37℃温育30min。 向以上混合液中加入300uL 10%SDS，混匀，与65℃温育10min。然后4000rpm，4℃离心10min。离心后移取上清液到灭菌的2ml离心管中。 向离心后的沉淀中加入450ul裂解液，100uL10%SDS, 混匀后65℃温育10min，4000rpm，4℃离心10min，取上清液到灭菌的2mL离心管中。此步骤重复两次 将三次取得的上清液混合，分装到灭菌的2mL离心管中，加入等体积的氯仿/异戊醇（24：1），反复颠倒混匀三次，12000rpm离心5min。小心移出上清（蛋白层很细小）到灭菌的2mL离心管中。 重复上步骤，将最后所得上清液置于灭菌的1.5mL离心管中 向上清液中加入0.6倍体积异丙醇，4℃放置至有丝状沉淀出现。12000rpm离心10min，小心弃去上清 向沉淀中加入1mL 4℃预冷70%乙醇洗涤沉淀。12000rpm离心2min，小心弃去上清。 将DNA沉淀置于无菌台中用无菌风吹干。向其中加入50uL无菌水（超纯水高温高压灭菌，以下步骤中无菌水均为灭菌超纯水），置于室温至其完全溶解。 10）将DNA置于-20℃保存