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低温保护剂的应用 在细胞冻存时加入低温保护剂，能大大提高冻存效果。 常用的低温保护剂是DMSO，它是一种渗透性保护剂，可迅速透入细胞，提高细胞膜对水的通透性，降低 冰点，延缓冻结过程，能使细胞内水分在冻结前 透出细胞外，在胞外形成冰晶，减少胞内冰晶， 从而减少冰晶对细胞的损伤。 细胞冻存方法 ① 预先配制冻存液：含20%血清培养基，10%DMSO，DMSO液用培养液配好，避免因临时配制产热而伤害细胞； ② 取对数生长期细胞，经胰酶消化后，加入适量冻存液，吸管吹打制成细胞悬液（1×106 ～5 ×106细胞/ml)； ③ 加入1ml细胞于冻存管中，密封后标记冷冻细胞名称 和冷冻日期。 细胞复苏方法 ① 从液氮中取出冷冻管，迅速投入37～38 ℃水浴中， 使其融化（1min左右）； ② 5min内用培养液稀释至原体积的10倍以上； ③ 低速离心10min； ④ 去上清，加新鲜培养液培养刚复苏的细胞。 培养基—天然培养基： 指来自动物体液或利用组织分离提取的一类培养基， 如血浆、血清、淋巴液、鸡胚浸出液等。 但是由于天然培养基制作过程复杂、批间差异大， 因此逐渐为合成培养基所替代。 目前广泛使用的天然培养基是血清，另外各种组织提取液、促进细胞贴壁的胶原类物质在培养某些特殊细胞也是必不可少。 血清(serum)：动物血清对细胞的生长繁殖发挥着重要 甚至是难以替代的作用。在动物血清的应用中牛血清 是最为广泛的，所以血清是医药生物技术产品中重要 的原材料之一。 ① 血清种类：目前用于组织培养的血清主要是牛血清，培养某些特殊细胞也用人血清、马血清等。 牛血清是细胞培养中用量最大的天然培养基，含有丰富的细胞生长必须的营养成份，具有极为重要的功能。 选择用牛血清培养细胞的原因：来源充足、制备技术成熟、经过长时间的应用考验人们对其有比较深入的理解。牛血清对绝大多数哺乳动物细胞都是适合的，但并不排除在培养某种细胞时使用其他动物血清更合适。 胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)取自剖腹产的胎牛； 新牛血清取自出生24小时之内的新生牛； 小牛血清(calf serum,CS)取自出生10-30天的小牛。 显然，胎牛血清是品质最高的， 因为胎牛还未接触外界，血清中所含的抗体、 补体等对细胞有害的成分最少。 ② 血清的主要成分： 血清是由血浆去除纤维蛋白而形成的一种很复杂的混合物，其组成成份虽大部分已知，但还有一部分尚不清楚，且血清组成及含量常随供血动物的性别、年龄、生理条件和营养条件不同而异。 血清中含有各种血浆蛋白、多肽、脂肪、碳水化合物、生长因子、激素、无机物等，这些物质对促进细胞生长或抑制生长活性是达到生理平衡的。 提供基本营养物质：氨基酸、维生素、无机物、脂类物质、核酸衍生物等，是细胞生长必须的物质。 提供激素和各种生长因子： 胰岛素、肾上腺皮质激素(氢化可的松,地塞米松)、类固醇激素(雌二醇,睾酮,孕酮)等。 生长因子如成纤维细胞生长因子、表皮生长因子、血小板生长因子等。 提供结合蛋白：结合蛋白作用是携带重要的低分子量物质，如白蛋白携带维生素、脂肪、以及激素等，转铁蛋白携带铁。结合蛋白在细胞代谢过程中起重要作用。 ③ 血清主要作用： 提供促接触和伸展因子使细胞贴壁免受机械损伤。 对培养中的细胞起到某些保护作用：有一些细胞，如内皮细胞、骨髓样细胞可以释放蛋白酶，血清中含有抗蛋白酶成分，起到中和作用。可使用血清来终止胰蛋白酶的消化作用。因为胰蛋白酶已经被广泛用于贴壁细胞的消化传代。 血清蛋白形成了血清的粘度，可以保护细胞免受机械损伤，特别是在悬浮培养搅拌时，粘度起到重要作用。血清还含有一些微量元素和离子，他们在代谢解毒中起重要作用，如SeO3，硒等。 ③ 血清主要作用： ④ 血清的使用与储存 使用前处理：大部分血清在使用前必须灭活处理，即56℃30min。灭活的目的是去除血清中的补体成分，避免补体对细胞产生毒性作用。对于一些品质高的胎牛血清和新牛血清可以考虑不经灭活直接用于细胞培养。 储存条件：血清一般储存于-20℃，同时应避免反复冻融。购买大包装的血清后，首先要灭活处理，然后分装成 小包装，储存于-20℃，使用前融化。融化时最好现置于4℃。融化后的血清在4℃不宜长时间存放，应尽快使用。 使用浓度：自从有了合成培养基，血清就是作为一种 添加成分与合成培养基混合使用，使用浓度一般为 5-20％，最常用是10％。过多血清容易使