生技整理考试重点.docVIP

说明：1、资料中未按名词解释、简答等的次序排版，如有需要，大家自行解决。 2、有些细节，大家自己去看课件补充吧 3、愿大家顺利。 一、基因工程 本章总体思路 1、生物技术：包括基因工程、细胞工程 、发酵工程 、酶工程 、蛋白质工程 2、基因工程：在体外对DNA进行切割、拼接, 使遗传物质重新组合, 经载体转移到细胞中扩增表达, 获得人类所需产品, 或组建新生物类型的技术。 3、基因工程诞生的理论基础：DNA是遗传物质；DNA双螺旋结构；中心法则和遗传密码 4、基因工程诞生的技术突破：DNA分子的体外切割与连接技术 DNA分子的核酸序列分析技术 5、基因工程元年：1973年 6、基因工程的特征：1. 跨物种性：外源基因到另一种不同的生物细胞内进行繁殖 2、无性扩增：外源DNA在寄主细胞内可大量扩增和高水平表达。 1.1 工具酶 7、工具酶：（以下为常用工具酶） 工 具 酶 功 能 限制性核酸内切酶 识别特异序列，切割DNA DNA连接酶 催化DNA中相邻的5′磷酸基和3′羟基末端之间形成磷酸二酯键，使DNA切口封合或使两个DNA分子或片段连接 DNA聚合酶Ⅰ 合成双链cDNA分子或片段连接 缺口平移制作高比活探针 DNA序列分析 填补3′末端 反转录酶 合成cDNA 替代DNA聚合酶I进行填补，标记或DNA序列分析 （含义：以RNA为模板合成DNA的DNA聚合酶） 多聚核苷酸激酶 催化多聚核苷酸5′羟基末端磷酸化，或标记探针 末端转移酶 在3′羟基末端进行同质多聚物加尾（1、探针标记2、在载体和待克隆的片段上形成同聚物尾，以便于进行连接） 碱性磷酸酶 切除末端磷酸基（制备载体时，用碱性磷酸酶处理后，可防止载体自身连接） 8、限制性核酸内切酶(restriction endonuclease, RE)： 是一类能识别双链DNA中特殊核苷酸序列, 并在合适的反应条件下使每条链一定位点上的磷酸二酯键断开，产生具有3’-OH基团和5’-磷酸基团的DNA片段的内切脱氧核糖核酸酶。 分类: 包括限制性核酸内切酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ（基因工程技术中常用Ⅱ型） 作用：与甲基化酶共同构成细菌的限制修饰系统，限制外源DNA， 保护自身DNA。 9、平末端 (blunt end): DNA的两条链在同一位置被切开，产生末端长度相等的DNA片段，即平末端。 粘末端(sticky end)：DNA分子的两条链在不同的位置（中间隔2-4核苷酸）被切开，形成一条交错的伤口，所得的DNA片段在末端都具有短的悬垂部分，即粘末端。 10、同裂酶：来源不同的限制性内切酶，但能识别和切割同一位点，这些酶称同裂酶。 同尾酶：有些限制性内切酶虽然识别序列不完全相同，但切割DNA后，产生相同的粘性末端，称为同尾酶。这两个相同的粘性末端称为配伍未端(compatible end)。 11、DNA连接酶的连接方式：1、粘性末端连接 2、平端连接 3. 末端修饰后进行连接 4. 人工接头连接 1.2 载体(vector) 12、载体：是指能在连接酶作用下和外源DNA片段连接，实现外源DNA的无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的DNA分子 13、理想载体的基本条件： 1、可转移性 2、具有安全性 3、合适的复制位点 4、多克隆位点：广泛、特异 5、选择标志，便于筛选和鉴定 6、分子较小，可容纳较大的外源DNA 14、质粒：存在于细菌染色体外的小型共价闭合环状DNA分子。 要求：含有复制起点；含有多克隆位点（MCS）；含有筛选标记； 高拷贝数；分子量小；易于导入宿主细胞 15、T-克隆载体：5’端带一个不配对的碱基T，这样的线性质粒可将PCR产物以TA配对连接的方式直接进行克隆，即TA克隆。用于TA克隆的载体被称为T-克隆载体 U-克隆载体：5’端带一个不配对的碱基U的线性质粒称为U-克隆载体 16、λ噬菌体克隆载体优点： ① 其分子遗传学背景十分清楚； ② 载体容量较大，能容纳大约23kb的外源DNA片段； ③ 具有较高的感染效率，其感染宿主细胞的效率几乎可达100% 。 λ噬菌体分类;(1) 插入型载体（insert vector）：其限制酶位点可用于外源DNA的插入 (2) 取代型载体（replacement vector）：具有成对限制酶位点，外源DNA可取代两个限制位点上的DNA区段。重组DNA与包装蛋白混合，可在体