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Your site here 基 因 敲 除 技术及其应用 Contents 基因敲除的步骤及方法 2 基因敲除的定义 1 基因敲除的应用 3 4 Sub title 基因敲除的定义 基因敲除 ( Gene knockout) 是指一种遗传工程技术，针对某个序列已知但功能未知的序列，改变生物的遗传基因，令特定的基因功能丧失作用，从而使部分功能被屏障，并可进一步对生物体造成影响，进而推测出该基因的生物学功能。 基因敲除的基本步骤 第一步：E S 细胞的获得 第二步：重组载体的构建 第三步：重组DNA转入受体细胞核内 第四步：目的细胞的筛选 第五步：转基因动物的获得 基因敲除的方法 一．C r e - L o x P系统 C r e -L o x P 系统属于传统的同源重组载体, 但是具有了时空调控的功能 。它由 C r e 重组酶和 L o x P位点两部分组成。 C r e -L o x P 系统可以实现对基因的不同发育阶段、 不同组织类型中特异性的删除 , 可以消除由于基因位置改变造成的影响, 加强了对基因的控制能力, 使研究者可以更方便地有针对性地进行目标阶段的研究工作;C r e -L o x P系统可以实现染色体间的基因重排;但同时也可以看出该系统对基因的了解要求极高, 并且对基因片段的操作能力要求也很高, 基因片段的大小通常在 10 k b 以上, 这些都不利于研究工作进行。 基因敲除的方法 二．转座子系统 转座子系统自从 20世纪 50年代被 Mc C l i n t o c k 发现以来, 已经成为许多组织器官进行基因分析的工具 。在人和小鼠的基因组中, 转座子衍生序列多达整个基因组的40 %, 这提示在发育过程中转座子有重要作用 。 转座子系统易于操作 , 所需时间短 , 具有高通量的特点 ,可以携带多种抗性标记 , 方便了同时进行多基因功能研究。但其应用范围有限, 适用于有一段克隆到的原始基因组序列, 长度在 10 ～ 15 k b , 且转座子应满足以下条件 :①转座子本身应该很短, 易于操作, 并对任何期望敲除区域有高效率;②在删除目的区域后应留下足够长的两臂用于同源重组。这些都限制了转座子的应用。 基因敲除的方法 三．基因捕获载体系统 基因捕获技术是将突变基因导入小鼠 E S细胞从而获得小鼠基因组文库 , 进行小鼠基因组的功能研究 , 它属于大规模随机敲除。典型的基因捕获载体通常包括一个无启动子的报道基因, 并通过调控元件使含有小鼠基因组文库的 E S 克隆很容易被选择性培养基筛选出来。 基因敲除的方法 四． H i t 和 R u n 法 H i t 和 R u n 法也称进退策略 。它包括两次同源重组 :第一步 ( H i t )用插入型载体进行同源重组 , 在靶位点插入带有突变的基因组序列以及带有两个筛选标记 ( 如 n e o 和 t k )的载体序列 ;第二步 ( R u n )利用 t k 抗性筛选 , 富集发生去除了含有负筛选标记基因的载体序列的回复突变的克隆 。 H i t 和 R u n法的不足之处是 :①无法精确控制染色体内的同源重组 , 可能会失去携带突变的同源序列 , 而保留未修饰的内源片段 ;②整个过程需要采用两种培养基分别进行先后两次筛选 ;③无法同时引进多个位点突变 。 基因敲除的方法 五 . 双置换法 双置换法也属于精细突变敲除 。它首先用含有 H p r t 基因的打靶载体转染H p r t - E S 细胞 , 通过在次黄嘌呤 、 氨喋呤和脱氧胸腺嘧啶苷培养基中筛选并用 P C R进行基因组分析 , 筛选发生同源重组 、 H p r t 基因阳性克隆 。然后用只携带突变同源序列的打靶载体转染上一步获得的 H p r t +E S 细胞 。同源重组发生后 , 突变序列将 H p r t 置换出来 。 这种方法的优点在于 , 第一步获得的 H p r t +E S 细胞 , 除了可用于产生普通的基因剔除小鼠外 , 也可以作为将不同突变引入靶基因的基础 。 基因敲除的研究和应用 1. 1 在人类疾病动物模型方面的应用 1. 2 基因和蛋白功能研究方面的应用 1. 3 药物依赖性研究方面的应用 1. 4 毒理学研究方面的应用1. 5 免疫学方面的应用 1. 5 免疫学方面的应用 1. 6 治疗措施研究方面的应用 在人类疾病研究方面的应用 人类几乎所有的疾病都与基因有关, 基因敲除动物模型的建立, 为研究人类疾病提供了一个崭新方法 ,尤其是遗传性疾病