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精液涂片制作与染色方法探讨* 杨绅1，方琪1，文荣砚1，加燕楠1，邱伟1，裴迅1，程艺杰1 发表于《祖国》杂志2014年2月下半月第4期第110面 【摘要】本文对29份精液标本通过不同的涂片方式和不同的染色方法进行比较分析，探索出一种较好的涂片方式和染色方法，同时制备一批良好的精子形态学涂片充实教学。 【关键词】精液；涂片方法；染色方法；精子形态 目前许多医院的实验室，精液常规检查常常是一个弱项，确定精子形态也是在不染色时粗略估计而确定的，误差很大，再则，具研究发现精子形态与男性不育症之间有重要联系，精子形态畸形是男性不育症的主要原因[1]，因此为了提高精子形态正确判断，就必须进行正确的涂片和良好的染色。 1、材料 1.1 标本来源： 襄阳中心医院门诊检验科患者精液标本29例（已液化），年龄26-37 岁。 1.2 试剂 固定液：甲醇、95%乙醇 染色液：吉姆萨染液、巴氏染液、瑞氏染液、H-E染液 2、方法 2.1 涂片方法 2.1.1顺时针涂抹法：用无菌棉签蘸取混合均匀的精液标本在清洁干燥的载玻片上由中央向边缘按顺时针方向均匀涂抹。 2.1.2一字型涂抹法：用无菌棉签蘸取混合混匀的精液标本在清洁干净的载玻片的一端以“一字型”方式向另一端移动涂抹均匀。 2.1.3拉片法：取清洁干燥的载玻片两张，于其中一张载玻片中央滴加混合均匀精液适量（2.5~10μl），然后将另一张载玻片充分的压盖在精液上，精液便在两片之间散开，然后向一侧抽拉上面的玻片，即可同时制得两张精液涂片。[2] 2.2染色方法 2.2.1吉姆萨染色法：将制备好的涂片立即放入甲醇固定3-5分钟，再将固定后的涂片上先滴加10滴pH6.4-6.8的磷酸盐缓冲液，再加吉姆萨染液1滴混匀，染10-30分钟，用流水冲洗，待干后镜检。 2.2.2H-E染色法：将制备好的涂片立即放入95%乙醇固定15-30分钟，流水冲洗1-2分钟，苏木素染液染1分钟，再大水冲洗5分钟，下面步骤同巴氏染色分色、蓝化，将涂片放入伊红Y染2-4分钟，放入两个装有95%乙醇的缸分别涮洗1-2次，放入无水乙醇固定1分钟，风干，封片镜检。 2.2.3巴氏染色法：将制备好的涂片立即放入95%乙醇固定15-30分钟；流水冲洗1-2分钟；苏木素染液染1分钟，再大水冲洗5分钟；分色：将涂片放入稀HCL中分色2次，每次3-5秒，然后立即水洗，再将涂片置稀碳酸锂溶液中篮化1分钟；立即水洗；放入桔黄G6染液染色3min,然后置入95%乙醇液中洗涤2次；再浸入EA36染液中染色4min，然后置95%乙醇液中洗涤两次，风干，封片镜检。 2.2.4瑞氏染色法：将制备好的涂片立即放入甲醇固定3-5分钟，将固定好的涂片放在水平位置上，先加瑞氏染液（Ⅰ液）数滴，以染液覆盖整个膜为宜，静置染0.5～1min，再滴加约2倍于Ⅰ液量的pH6.4-6.8磷酸盐缓冲溶液（Ⅱ液），用洗耳球立即将两液混匀，染色5－10min，平持载玻片用流线型水洗，干燥镜检。 3．结果分析 3.1结果 精液涂片方式和染色方法结果比较见附表1、2 附表1.精液涂片方法比较 精子分布 精子数量 精子形态 顺时针法 分布不均匀，有聚集现象 偏少 尾巴交错不易观察 一字型法 分布稀疏，偶见聚集现象 稀少 形态良好 拉片法 分布均匀，无明显聚集现象 适宜 形态良好 备注：同一份标本不同的涂片方式 附表2.精液涂片染色结果比较 方法 精子形态 背景细胞 背景 吉姆萨染色法 头体尾分明 易区分 清洁 H-E染色法 头体分明，尾部着色差 不易区分 较清洁 巴氏染色法 头体分明，尾部着色差 较易区分 清洁 瑞氏染色法 头体尾尚分明 较易区分 有较多沉渣 备注：同一份标本同一种制片方式不同的染色方法 3.2 讨论 综上所述拉片法是三种涂片方法中精子形态展现较好的一种方法。涂片厚薄均匀，精子形态保存完整，没有成团聚集现象，整个涂片中精子单个分布易于观察。染色方法中吉姆萨染色法染色效果较好，对精子各部位着色分明，易于辨认，尤其是对背景的不成熟精母细胞和白细胞易区分。故在男性不育症检查，精子形态分析中，应选择拉片方式制片和吉姆萨染色法染色。 【参考文献】 [1]《中国男科学杂志》2011年25卷11期 [2] 叶应妩，王毓三主编．全国临床检验操作规程[M]．南京：东南大学出版社2005． 1