实验五酵母菌的形态观察死活细胞的鉴别及显微镜直接计数法分析.pptVIP

酵母菌的形态观察、死活细胞鉴别及显微镜直接计数法 一、实验目的 1、观察酵母菌的形态及出芽生殖方式，学习区分酵母菌死活细胞的实验方法。 2、明确血细胞计数板的原理，掌握使用血细胞计数板进行微生物计数的方法。 二、实验原理 酵母菌是不运动的单细胞真核微生物，其大小通常比常见细菌大几倍甚至十几倍。大多酵母菌以出芽方式进行无性繁殖，有的分裂繁殖，有性繁殖是通过接合产生子囊孢子。本实验是通过美蓝染液水浸片来观察酵母菌的形态和出芽生殖方式。 美蓝是一种无毒性的染料，它的氧化型呈兰色，还原型无色，用美蓝对酵母的活细胞进行染色时，由于细胞的新陈代谢作用，细胞内具有较强的还原能力，能使美蓝由兰色的氧化型变为无色的还原型。因此，具有还原能力的酵母活细胞是无色的，而死细胞或代谢作用微弱的衰老细胞则呈兰色或淡兰色，借此即可对酵母菌的死细胞和活细胞进行鉴别。但美蓝的浓度、作用时间等均有影响，应加注意。 显微镜直接计数法是将小量待测样品的悬浮液置于一种特别的具有特定面积和容积的载玻片上(又称计菌器），于显微镜下直接计数的一种简便、快速、直观的方法。目前国内常用的计菌器有：血细胞计数板、Peteroff-Hauser计菌器以及Hawksley计菌器等，它们都可用于酵母、细菌、霉菌孢子等悬液的计数。 利用血细胞计数板在显微镜下直接计数是一种常用的微生物计数方法。该计数板是一块特制的载玻片，其上由四条槽构成三个平台，中间较宽的平台又被一短横槽隔成两半，每一边的平台上各刻有一个方格网，每个方格网共分为几个大方格，中间的大方格即为计数室。血细胞计数板构造如图1，计数室的刻度一般有两种规格，一种是一个大方格分成25个中方格，而每个中方格又分成16个小方格，另一种是一个大方格分成16个中方格，而每个中方格又分成25个小方格，但无论是哪一种规格的计数板，每一个大方格中的小方格400个，每一个大方格边长为1毫米，则每一个大方格的面积为1mm2，盖上盖玻片后，盖玻片与载玻片之间的高度为0.1毫米，所以计数室的容积为0.1mm3（万分之一毫升）。 平台中央的方格网（有九个大方格） 中央的大方格为计数室 (25×16型) 计数时，通常数五个中方格的总菌数，然后求得每个中方格的平均值，再乘上25（或16），就得出一个大方格中的总菌数，然后再换算成毫升菌液中的总菌数。 设五个中方格中总菌数A，菌液稀释倍数B，如果是25个中方格的计数板，则 1ml菌液中的总菌数=A/5×25×104×B=50000AB 同理，如果是16个中方格的计数板，则 1ml菌液中的总菌数=A/4×16×104×B=50000AB 三、实验器材： 1、菌种：酿酒酵母 2、仪器或其他用品：血细胞计数板，显微镜，盖玻片，载玻片等 3、0.1%美蓝染色液等 四、实验内容： 1、美蓝浸片观察 在载玻片中央加一滴0.1%的美蓝染色液，然后用接种环取少量酵母菌于染液中，混合均匀；（本次实验美兰染液浓度为0.2%，取菌悬液一滴加染液一滴混合均匀。） 用镊子取一块盖玻片，先将一边与菌液接触，然后慢慢将盖玻片放下，使其盖在菌液上。将玻片放置约三分钟后，用显微镜观察酵母的形态和出芽情况，并判断细胞的死活。 2、显微镜计数 ①、菌悬液的制备（本次稀释倍数为50）； ②、清洗血球计数板； ③、加样品 将血细胞计数板盖上盖玻片，再用滴管将刚混匀的菌悬液由盖玻片边缘滴一小滴，让菌液沿缝隙靠毛细渗透作用自动进入计数室。 ④、显微镜计数 ⑤、清洗血细胞计数板 五、实验报告 1、绘图说明你所观察的酵母菌的形态特征 2、填表： 各中格中菌数 A B 二次平均值 菌数/ml 1 2 3 4 5 50