谢德鑫实验四可溶性糖的硅胶G薄层层析.docVIP

实验四 可溶性糖的硅胶G薄层层析 生物技术111 201110414134 谢德鑫 1目的： 1．1掌握薄层层析法的基本原理和方法。 1．2掌握可溶性糖分离鉴定的原理和方法。 1. 3 熟悉用蒽酮试剂对糖的定量测定方法。 2原理： 薄层层析(TLC)是吸附剂或支持剂均匀有效地涂布在薄层上进行的层析，是一种微量而快速的层析方法。硅胶、氧化铝和聚酰胺是广泛采用的吸附剂，硅藻土和纤维素是分配层析中最常用的支持剂，在吸附剂或支持剂中添加了合适的黏合剂后再涂布，可使薄层黏牢在玻璃板(或涤纶片基)这类基底上。 硅胶G是一种添加了黏合剂的硅胶粉，约含12％～13％的石膏，它可以把—些物质从溶液中吸附于自身的表面上，利用它对各种物质的吸附能力不同，再用适当的溶剂系统展层，使不同的物质得以分离，使用显色剂显色，得到不同的Rf值。糖在硅胶薄层上的移动速度与糖的相对分子质量和羟基数有关，经过适当的溶剂展开后，糖在薄板上的移动速度是戊糖己糖双糖三糖。对已分开的斑点显色，而将与它位置相当的另—个未显色的斑点从薄层上与硅胶G一起刮下，用适当的溶剂将糖从硅胶G上洗脱下来，就可用糖的定量测定方法测出各组分的含糖量。 3仪器及材料及试剂 3.1仪器： 烘箱，吹风筒，喷雾器，分光光度计，微量进样器，层析缸，点样毛细管。薄层玻璃板(20cmX 20 cm)，试管(15 mLX 24)。 3.2材料及试剂：木糖、葡萄糖、果糖和蔗糖标准溶液。 糖标准溶液：取木糖、葡萄糖、果糖和蔗糖各100 mg，分别用75％乙醇定容至10mL，其质量浓度均为10 mg／mL。层析溶剂：氯仿：甲醇 = 60 ：40（V／V)。苯胺—二苯胺—磷酸显色剂：1 g二苯胺，苯胺1 mL和85％磷酸5 mL溶于50 mL丙酮中。 0.1mol／L硼酸溶液(H3BO3)，硅胶G粉。 4操作步骤： 4.1制备硅胶G薄层板 ：取硅胶G粉30 g，加入75 mL 0.1 mol／L硼酸溶液中，调匀后铺于洁净、平整的玻璃板上，铺层后的薄板于100℃烘箱中烘干。取出后可贮于干燥器中备用。薄层表面要求平整，厚薄均匀。 4.2糖在硅胶G薄层上的分离 ：选取制备好的薄层板一块，在距底边1．5 cm的直线上选4个点，相互距离2 cm。用毛细管分别点上不同的糖样品于4个点，点样量控制在5～10 ug，边点样边吹干，斑点直径不超过3mm。待薄层板上样品自然干燥后，将薄板置于盛有层析溶剂的层析缸中，自下向上展层，当展层溶剂到达离薄板顶端约1 cm处时取出薄板，前沿作一记号，于60℃烘干2～3 h(或空气中晾干)，挥发尽溶剂后用喷雾器均匀地喷上显色剂，于85℃烘烤10 min，则各种糖分别显出不同的颜色。测量计算Rf值。 5结果分析： 记下各斑点的位置、颜色，计算Rf值，绘出层析图谱进行分析。各种糖显色后的呈色如表所示； 糖种类 木糖 葡萄糖 果糖 蔗糖 呈色 黄绿色 灰蓝绿色 棕红色 蓝褐色 图像如右图： 戊糖（木糖）己糖（葡萄糖）双糖（蔗糖）三糖（果糖） 测量得到Rf（木糖）=