实验 亲和层析纯化IgG.pptVIP

生物分离与纯化实验 共34学时 持续改进 协作 实验报告： 1.信息栏填全，遗漏项：同组人员； 2.结果计算：过程完整 3.讨论分析不可缺项，内容丰满，见解细致。 上次实验总结 实验（三）血清中抗体纯化（16学时） 配基 特异性 Protein A 许多IgGs 的Fc 片断 Protein G 许多IgGs 的Fc 片断 Antigen 特异的抗体 Anti-IgG 特异免疫球蛋白 抗体纯化配基类型 族特异性 专一特异性 二、实验原理 低 pH下洗脱 用 rProtein A Sepharose? 分离IgG Column: HiTrap? Protein A FF 结合缓冲液: 20 mM 磷酸钠, pH 7.0 洗脱缓冲液: 0.1 M 甘氨酸- HCl, pH 3 注意: 为了保护抗体的活性，将洗脱组分收集于 1 M Tris-HCl, pH 7.5中 二、实验原理 二、实验原理蛋白 A 和 蛋白 G 的结合特异性 种属 蛋白 A 蛋白 G 结合 结合 人 IgA 可变的 - IgD - - IgE IgG1 ++++ ++++ IgG2 ++++ ++++ IgG3 - ++++ IgG4 ++++ ++++ IgM* 可变的 - 鸟类蛋黄 IgY? - - 牛 ++ ++++ 狗 ++ + 山羊 - ++ 豚鼠 IgG1 ++++ ++ IgG2 ++++ ++ 仓鼠 + ++ 马 ++ ++++ 考拉 - + 骆驼 - + 种属 蛋白 A 蛋白 G 结合 结合 恒河猴 ++++ ++++ 大鼠 IgG1 + ++++ IgG2a ++++ ++++ IgG2b +++ +++ IgG3 ++ +++ IgM* 可变的 - 猪 +++ +++ 兔 ++++ +++ 小鼠 IgG1 - + IgG2a - ++++ IgG2b - ++ IgG3 + ++ 绵羊 +/- ++ + 相对结合强度 – 弱或不结合 三、实验材料——纯化 试剂：磷酸二氢钠、磷酸氢钠、氯化钠、异地酸二钠、枸橼酸、精氨酸、盐酸胍、氢氧化钠、95%乙醇；均为分析纯。 容器：50ml烧杯/三角瓶/试管10个；15ml收集试管5个；100ml三角瓶 5个；250ml烧杯5个 填料：Protein A 层析柱：XK10或预充柱 装柱体积：~2ml 血清：~2ml 滤器： 0.45μm针头式滤器5个； SDS: 缓冲液： 平衡液：20mM磷酸二氢钠，150mM氯化钠，pH7.2；(1L) 冲洗液：20mM磷酸二氢钠，0.5M氯化钠，10mM EDTA二钠，pH7.2；(1L) 洗脱液：0.1M Glycine-HCl，pH3.5；(1L) 清洗液：6mM氢氧化钠。(1L) 稀释血清： 取2ml血清，用平衡缓冲液稀释5倍，0.45um针头滤器过滤。标记为S. 三、实验材料——纯化 三、实验材料——SDS试剂： 1. 2x样品缓冲液 2. 凝胶贮液：在通风橱中，称取丙烯酰胺30g，甲叉双丙烯酰胺0.8g，加重蒸水溶解后，定容到100ml，过滤。 3. pH8.9分离胶缓冲液： Tris 36.3g ，加1mol/L HCl 48ml，加重蒸水80ml使其溶解，调pH8.9，定容至100ml， 4℃保存。 4. pH6.7浓缩胶缓冲液： Tris 5.98g ，加1mol/L HCl 48ml，加重蒸水80ml使其溶解，调pH6.7，定容至100ml， 4℃保存。 5. TEMED（四乙基乙二胺）原液 6.10%过硫酸铵（用重蒸水新鲜配制） 7. pH8.3 Tris-甘氨酸电极缓冲液：称取Tris 6.0g，甘氨酸28.8g，加蒸馏水约900ml，调pH8.3后，用蒸馏水定容至1000ml。置4℃保存，临用前稀释10倍（减半配制）。 8. 考马斯亮蓝G250染色液：称100mg考马斯亮蓝G250，溶于200ml蒸馏水中，慢慢加入7.5ml 70%的过氯酸，最后补足水到250ml，搅拌1小时，小孔滤纸过滤。 器材： 电泳仪，电泳槽，水浴锅，摇床。 三、实验试剂——浓度测定 考马斯亮蓝G-250蛋白染色液 (1)牛血清白蛋白标准液（100ug/ml） 精确称取0.010g牛血清白蛋白，溶于约50ml蒸馏水，定容到100ml. (2) 考马斯亮蓝G-250试剂 取100mg考马斯亮蓝G-250，溶于50ml 90%乙醇中，加入85%正磷酸100ml，最后用蒸馏水定容到1000ml，此试剂在常