HCMV-pp65报告.pptVIP

临床意义 : 人巨细胞病毒感染在人群中极为常见，发达国家HCMV抗体阳性率40％－80％，而在发展中国家的HCMV抗体阳性率高达90％－100％。 应用免疫荧光技术检测外周血白细胞内存在的低基质65kd磷酸蛋白（PP65），此蛋白是一种蛋白激酶。 检测外周血白细胞内HCMVpp65含量用于检测HCMV急性期或恢复期感染。 优势: HCMVPP65抗原血症检测试剂采用快速、定量、简单、敏感和易于读取结果的方法检测活性CMV感染。 比病毒分离快速培养和血清学方法敏感，对已经出现临床症状的患者检测敏感度是100％。 疾病发作的几天到1周时间内抗原血症能够被检测出，比快速培养法早2－25天。 当实验室不能进行细胞培养时可应用抗原血症检测。 采用的PP65单克隆混合抗体能够增加阳性样本细胞的着色数量并且显示一个更加明亮的荧光场景 检测人群： 用于诊断和跟踪心脏、肺脏、肝脏、肾脏和骨髓移植接受者体内的HCMV感染 。 艾滋病患者体内的HCMV感染。 检验原理 采用混合单克隆抗体（IA6+4A8）标记不同的抗原决定族结合位点表达在外周血白细胞和单核细胞内的65－68kd磷酸蛋白（蛋白激酶PP65） 当病毒在血液散布期间混合单克隆抗体可以识别存在于外周血受感染的分叶核白细胞和单核白细胞的HCMV核蛋白内的2个抗原决定族。 试验步骤 一.外周血中白细胞的分离.提取 1. 取10ML试管，加入静脉抗凝血3－4ML，加入 1.5MLPBS 2. 加入5％Dextran0.5ML,轻轻翻转试管混匀 3. 37℃恒温箱，倾斜45°放置18－20分钟 4. 吸取RBS上方的白细胞富集层，置于10ML试管中 5. 离心10分钟，1500转/分 6. 弃上清，加入1×RBS裂解液 7. 室温（15－30 ℃ ）放置10分钟，裂解RBC 8. 继续加入5mlPBS，离心同步骤5 9. 如白细胞沉淀中还有RBC，重复7－9步骤 10. 弃上清，5mlPBS洗涤WBC一次，同步骤5 11. 弃上清，0.5mlPBS悬浮WBC 二.白细胞滴片的制备 细胞计数板计数并调整白细胞浓度至4×106/ml 取出经多聚赖氨酸处理的载玻片.编号.滴片.干燥 固定液固定WBC，室温10分钟 PBS洗涤玻片3分钟/次，3次 立即染色 三.染色 每个WBC滴片滴上一滴1抗，阴阳性对照片同时滴加。 玻片放入湿盒，并将湿盒放入37℃恒温箱30分钟 取出玻片在PBS中浸泡洗涤3分钟3次 于WBC滴片上滴加一滴荧光素标记的2抗，放入湿盒，37℃恒温箱，3分钟。 取出玻片轻轻洗涤玻片3分钟，3次。 蒸馏水洗涤玻片3次；吸干； 甘油封片； 在40倍荧光显微镜下观察实验结果。 四.结果的判定 （一）分级 结果报告分为阴性、弱阳性、阳性、强阳性四个等级。 判定结果的前提是实验操作严格，阴阳性对照片染色良好，未出现假阳性或假阴性着色。一个高倍视野下（400×）检见白细胞数应大于20个。 阴性：2个染色标本中未检见明确的阳性细胞，或不典型性阳性细胞少于5个，患者无临床症状，其他相关实验室检查无阳性表现 弱阳性：2个染色标本中检见散在分布的不典型阳性细胞少于10个，患者无明显临床症状，其他相关实验室检查部分阳性表现。 阳性：2个染色标本中检见散在分布典型阳性细胞大于3个，或散在分布不典型阳性细胞大于10个，患者存在临床症状，其他相关实验室检查部分阳性表现。 强阳性：2个染色标本中检见散在分布多量典型阳性细胞，患者存在明显临床症状，其他相关实验室检查阳性表现。 （二）阴性结果及细胞判定标准 阴性细胞判定标准：良好的细胞形态，细胞核为圆形、肾形、（分叶状、杆状较少见）细胞核无着色。 荧光显微镜下标本背景为暗红色或无明显着色。 （三）阳性结果及细胞判定标准 阳性细胞判定标准： 良好的细胞形态，细胞核为圆形、肾形、（分叶状、杆状较少见）荧光照射呈暗绿色或苹果绿色，细胞核周围呈暗红色或无着色。 不典型阳性细胞判断标准 细胞形态欠佳，细胞核形态欠佳着色不清晰。 五、标本读片时视野较暗无法分辨细胞形态时应注意以下问题： 制片过程最后蒸馏水冲洗不彻底；载玻片、盖玻片不洁净；封片剂用量过多。 应选择在暗室内读片，室内光线越暗越好。 荧光发生器功率应选择100W为宜，功率为50W的荧光发生器不宜观察 调整荧光显微镜使其荧光位于视野中央易于观察 读片时应使用40倍物镜观察 调准细胞层面 六、标本中杂质的区分 标本制片过程中难以避免的掺入一些杂质，这些物质在荧光显微镜下会发出绿色荧光，少部分发出红色荧光，区分这些杂质对诊断尤为关键 。 观察杂质形态多数杂质为不规则或呈椭圆行与正常细胞较易区分 杂质在荧光照射下发出明亮的绿色荧光 难以明确其是否为杂质时可打开