PRRS实验室诊断监测报告.pptVIP

PRRS实验室诊断监测技术  -----RT-PCR检测技术 黑龙江省动物卫生监督所 主 要 内 容 PCR 技术 PRRSV RT-PCR 检测技术 动物病毒的组成 两部分 1. 蛋白质：HA、HI、ELISA 2. 核酸：分为两种 脱氧核糖核酸（DNA）---PCR 核糖核酸（RNA）---RT-PCR PRRS病毒粒子的结构 PCR 技术 概念 PCR是一种在体外模拟自然DNA复制过程的核酸扩增技术，它以待扩增的两条DNA链为模板，由一对人工合成的寡核苷酸引物介导，通过DNA聚合酶酶促反应，快速体外扩增特异DNA序列。 PCR技术简史 1988年Saiki 等从温泉中分离的一株水生嗜热杆菌(thermus aquaticus) 中提取到一种耐热DNA聚合酶。此酶具有以下特点：①耐高温，在70℃下反应2h后其残留活性大于原来的90%，在93℃下反应2h后其残留活性是原来的60%，在95℃下反应2h后其残留活性是原来的40%。②在热变性时不会被钝化，不必在每次扩增反应后再加新酶。③大大提高了扩增片段特异性和扩增效率，增加了扩增长度(2.0Kb)。由于提高了扩增的特异性和效率，因而其灵敏性也大大提高。 基本原理 适量的缓冲液, 微量的模板DNA,四种脱氧单核苷酸,耐热性多聚酶, 一对合成DNA的引物,通过高温变性、低温退火和中温延伸三个阶段为一个循环,每一次循环使特异区段的基因拷贝数放大一倍,一般样品是经过30次循环,最终使基因放大了数百万倍; 扩增了特异区段的DNA带。 PCR反应条件 1）PCR反应成分 （1）模板 单、双链DNA均可。 不能混有蛋白酶，特别是染色体中的组蛋白、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂、DNA结合蛋白类。 一般100ng DNA模板/100?L。 模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。 （2）引物浓度 0.1-0.5 ?mol/L 浓度过高易导致模板与引物错配,反应非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。 （3）Taq DNA聚合酶 0.5-2.5 U/50 ?l 酶量过高可引起反应非特异性扩增;酶量过少则合成产物量减少。 （4）dNTP dNTP浓度取决于扩增片段的长度 四种dNTP浓度应相等，如果有一种浓度不同于其他几种，就会引起错配。 浓度过高易产生错误碱基的掺入，浓度过低则降低反应产量 dNTP可与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度下降，影响DNA聚合酶的活性。 （5） Mg2+ Mg2+是DNA聚合酶的激活剂。 0.5mmol/L-2.5mmol/L反应体系。 Mg2+浓度过低会使Taq酶活性丧失、PCR产量下降； Mg2+过高反应特异性降低，出现非特异扩增。 Mg2+可与负离子结合，所以反应体系中dNTP、EDTA等的浓度影响反应中游离的Mg2+浓度。 2）循环参数 变性 一般情况下，93℃～94℃lmin足以使模板DNA变性，若低于93℃则需延长时间，但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影响。此步若不能使靶基因模板或PCR产物完全变性，就会导致PCR失败。 (2) 退火 退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基序列的长度。引物的复性温度可通过以下公式帮助选择合适的温度： Tm值(解链温度)=4(G+C)＋2(A+T)　　　　　复性温度=Tm值-(5～10℃)　　在Tm值允许范围内，选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合，提高PCR反应的特异性。复性时间一般为30～60sec，足以使引物与模板之间完全结合。 3）延伸 PCR反应的延伸温度一般选择在70～75℃之间，常用 温度为72℃，过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。PCR 延伸反应的时间，可根据待扩增片段的长度而定。延伸进间过长会导致非特异性扩增带的出现。对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些。 （4）循环次数 主要取决于模版DNA的浓度 一般为25-35次 次数过多：扩增效率降低 错误掺入率增加 PCR的特点 特异性强 PCR反应的特异性决定因素为：　　　①引物与模板DNA特异正确的结合；　　 ②碱基配对原则；　　　 ③Taq DNA聚合酶合成反应的忠实性；　　　 ④靶基因的特异性与保守性。 灵敏度高 皮克(pg=10-12)量级扩增到微克(ug=10-6)水平 能从100万个细胞