生长曲线课件.pptVIP

概述 步骤 1，取生长状态良好的细胞，消化制成悬液。经计数后，精确地将细胞分别接种于21~30个大小一致的细胞瓶里（常用10ml培养瓶，也可用24孔培养板）每瓶接种细胞量要求一致，加入培养液也一致。细胞接种数不能过多也不能过少。太少细胞适应期太长，太多细胞将很快进入增殖稳定期。一般接种量以7-10天能长满而不发生生长抑制为度。同种细胞的生长曲线先后测定要采用同一接种密度，才能做纵向对比。不同的细胞也要接种细胞数相同，才能进行比较。 2，酌情每天或每隔一天取出三瓶细胞进行计数，计算均值。一般每隔24h取一瓶连续观察1~2周或到细胞总数有明显减少为止（一般需10天左右）。培养3~5天后常要给未计数的细胞换液。 3，以培养时间为横轴，细胞数为纵轴（对数），描绘在半对数坐标纸上。连接成曲线即为该细胞生长曲线。 实验原理 一般细胞传代之后，经过短暂的悬浮后贴壁，随后度过长短不一的潜伏期，即进入大量分裂的指数生长期，在达到饱和密度后，细胞停止生长，进入平顶期，然后退化衰老。 典型的生长曲线即可分为潜伏期、指数生长期、平台期及退化衰老四个部分，其中的三个不同生长时相（潜伏期、指数生长期和平顶期）是每个细胞系所共有的特征。通过测定生长曲线，不仅可以了解培养细胞生物学特性的基本参数、测定细胞绝对生长数、判断细胞活力，而且也可用于测定药物等外来因素对细胞生长的影响。 结果分析 标准的生长曲线近似S形，一般在传代后第一天细胞数有所减少，经过几天的潜伏适应期，进入对数生长期，达到平台期后生长稳定，最后衰老。 在细胞生长曲线上细胞数量增加一倍的时间称为细胞倍增时间，可以从曲线上换算出。细胞倍增的时间区间即细胞对数生长期。细胞传代实验等多在此区进行。 实验汇报 12日，三瓶细胞均铺满瓶底，冻了两瓶，剩下一瓶一传三，预计周五换液。 14日换液，细胞生长约瓶底70%，预计周日冻存两支，再一传三。 16日早晨去见细胞片状浮起，弃掉旧培养液，pbs清洗后见瓶底仍有少量细胞贴附，遂将三瓶消化转移至新瓶(A)继续培养。 分析原因：1，周五细胞密度已经较大，应传代 2，细胞生长特别迅速（很多分裂相），加上密度大，周日情况应是细胞密度抑制及代谢酸中毒。 17日上午见(A)仍有较多单个细胞漂浮，背景很脏（小黑点）,反复冲洗，换液，见少量细胞贴附瓶底。 17日下午复苏一支细胞(B)。 18日见 (B)细胞部分贴附，换液，细胞较少； (A)个别细胞漂浮，背景较脏。 19日见（B）细胞仍较少; (A)细胞变圆，少量漂浮，换液 20日见(B)细胞略有增多，见分裂相细胞。背景稍脏，预计明日换液 （A)细胞仍有悬浮细胞，背景脏，拟丢弃。 分析原因：（A）虽然瓶壁有少量贴壁细胞，但状态应该也不好，加上消化，所以转移至新瓶生长不好。 细胞悬液制备：取生长良好接近汇合的细胞，胰酶消化，再加新鲜培养基制成细胞悬液后计数。 接种：根据细胞计数结果，按每瓶5×104个接种细胞，作传代培养（接种七组，每组三孔）。 计数：24h后开始作细胞计数，以后每隔24h计数一次，连续计数7天。 绘图：根据计数结果，绘制细胞生长曲线。（横轴时间天数，纵轴细胞数，万/mL） 细胞生长曲线的绘制及注意事项 取对数生长期细胞，用胰酶消化收集，调整单细胞悬液密度为104~105个/mL视细胞贴壁后的大小，倍增时间等因素确定接种密度。按200μl/孔（1×104个细胞）接种于96孔培养板内，每组细胞接种5个孔，取平均值，切记各孔的接种密度一致。 置37℃、5％CO2气相和饱和湿度的CO2培养箱中培养，