酵母细胞表面展示.pptxVIP

酵母细胞表面展示技术及其在高通量筛选中的应用;;;酵母细胞表面展示技术的概述;基本原理：是将外源靶蛋白基因与特定的载体基因序列融合后导入酵母细胞，用酵母细胞内蛋白转运机制将目的蛋白转移至细胞表面并且固定在细胞膜上。与其它表面展示系统相比,酵母表面展示系统可克服真核蛋白在原核细胞表达时活性降低或失活的缺点。 ; 最常见的酵母表面展示表达系统包括: 凝集素展示表达和絮凝素展示表达 ;凝集素系统又分为α-凝集素(Agα)系统和a-凝集素(Aga) 系统;絮凝素展示表达系统利用絮凝素基因与外源蛋白融合,并将融合蛋白展露表达在细胞表面，此系统又包括两个子统:GPI锚定系统和絮凝结构域锚定系统。;酵母表面展示技术的特点;酵母表面展示; 为了简化纤维素乙醇生产工艺，实现纤维素利用与乙醇发酵的同步进行，莫春玲等通过酵母细胞表面展示技术，以酿酒酵母菌株 Saccharomyces cerevisiae Y5 为受体，通过絮凝素 (Flo1p) 锚定方式，将来自丝状真菌里氏木霉 Trichoderma reesei 的内切葡聚糖酶Ⅱ(EGII)、纤维二糖水解酶Ⅱ(CBHII)以及来自棘孢曲霉 Aspergillusaculeatus 的 β-葡糖苷酶Ⅰ(BGLI) 展示在细胞表面，构建同时表达 3 种纤维素酶的酵母菌群系统。 经过免疫荧光验证展示酶的细胞蛋白定位，酶活测定，乙醇发酵性能验证，结果表明：展示表达的3种纤维素酶具有良好的稳定性和功能活性；; 该系统已经得到成功开发，但是在这一领域里仍有许多亟待解决的问题，例如：展示在细胞表面的纤维素酶的活性与游离酶相比有所下降；成功展示的纤维素酶稳定性有待提高。;酵母细胞表面展示技术在高通量筛选中的应用;什么是high-throughput screening;高通量筛选的技术过程;药物筛选;药物筛选;　直接活性筛选 　可通过酵母系统直接进行化合物活性筛选，这主要源于两种情况: (1)在离子转运缺陷的酵母菌株中重建人的离子通道，会产生补充生长的表型； (2)在酵母中表达离子通道蛋白可导致酵母生长缺陷。 在筛选离子通道抑制剂时，前种情况可筛选那些导致酵母生长受抑的化合物，而后种情况下则可筛选那些能使酵母细胞恢复生长的化合物。; Hahnenberger和Kurtz 建立了酵母展示的系统来筛选钾离子通道、质子通道和钠/氢离子通道的抑制剂。其中，流行性感冒质子通道蛋白M2的表达能导致酵母生长缺陷，因此，理论上那些能使酵母恢复生长的化合物就是M2的抑制剂。据此，他们筛选得到了一个流行性感冒质子通道蛋白的抑制剂。此外，在利用生长抑制的方法进行抑制剂筛选实验中，由于那些具细胞毒性的化合物虽然不是离子通道抑制剂，也能阻碍酵母生长。为此，Hahnenberger和Kurtz设计了微生理测量计，能检测出反映离子通道功能的pH变化，为假阳性的剔除提供了一个快速的二次检验方法。 ;酵母双杂交筛选 由于离子通道蛋白是多亚基结构，亚基间的作用一旦被破坏，离子通道的功能就会受到影响，因此，利用酵母双杂交可筛选那些破坏亚基间相互作用的化合物，即该离子通道的抑制剂。 Young等成功筛选得到了能抑制N-型钙离子通道β3亚基和α1B 亚基间相互作用的化合物，且这些化合物在随后的功能性实验中的确表现出了钙离子通道抑制剂的活性。这些工作不仅成功地将酵母双杂交应用于药物筛选，而且还把酵母双杂交成功地引入到膜蛋白相互作用的研究中。;;通常被选的展示系统应该满足以下几个条件： 1. 表达偏差应该是最小的，以便DNA库的多样性可代表正确折叠蛋白质的多样性。 2. 要有定量筛选的标准。 3. 被选系统必须能很好的区分仅有微弱亲和力差别的突变体。;为什么要通过酵母细胞展示进行高通量筛选;1. 酿酒酵母的蛋白质折叠和分泌机制与哺乳动物细胞非常相似，因而比原核细胞更能正确表达和展示人的蛋白质。 2. 与噬菌体不同，酵母是个足够大的颗粒，可用流式细胞仪进行筛选和分离，这就使得基于特异定量亲和力改变的突变体分离成为可能。 3. 由于酵母展示的蛋白质是紧密锚定在细胞壁上，可以耐受SDS等的抽提，同时酵母有发酵特性且生长快，因此在工业上具有很好的应用前景。 4. 在应用过程中，细胞表面展示技术结合流式细胞仪在筛选的高通量和测定单细胞水平的酶动力学之间达成很好平衡。甚至在高密度的固体形态或微量滴定量L板测活，也能准确定量酶的活力。; 综上所述，基于酵母展示系统的高通量筛选技术在工业应用上的前景将非常广阔。;THANKS