切片实验理论教程剖析.ppt

超薄切片技术主要包括取材、固定、包埋、切片、染色等步骤。 透射电镜标本制备： 1、固定 （戊二醛与锇酸等） 2、包埋（树脂） 3、切片（50-80nm) 4、染色（醋酸铀和柠檬酸铅等重金属）标本在荧光屏上呈黑白反差的结构影像。 电子密度高、电子密度低：被重金属浸染呈黑色的结构，称电子密度高；反之，浅染的部分称电子密度 内质网透射电镜图 ? 超薄切片技术 用于电镜观察的样本制备，观察组织、细胞内部超微结构。分辨率0.2nm。 ?负染色技术（Negative staining） 染色背景，衬托出样品的精细结构 ?冰冻蚀刻技术（Freeze etching） 冰冻断裂与蚀刻复型：主要用来观察膜断裂面的蛋白质颗粒 和膜表面结构。 ?电镜三维重构技术 电子显微术、电子衍射与计算机图象处理相结合而形成的具有重要应用前景的一门新技术。 电镜三维重构技术与X-射线晶体衍射技术及核磁共振分析技术相结合，是当前结构生物学（Structural Biology）（主要研究生物大分子空间结构及其相互关系）的主要实验手段。  主要电镜制样技术 2.扫描电子显微镜技术（scanning electron microscope） 扫描电子显微镜技术要观察的组织不需制成切片。 固定后的标本，在其表面喷镀金，在荧光屏上即可显示细胞或组织表面的立体结构。 如细胞表面的突起、微绒毛、纤毛等。 利用二次电子信号成像来观察样品的表面形态。电子“探针”扫描，激发样品表面放出二次电子，探测器收集二次电子成像。 实验原理 组织化学术(histochemistry) 通过化学或物理反应原理,在切片上加某种试剂，和组织中的待检物质发生化学反应，其最终产物或为有色沉淀物，以光镜观察；或为重金属沉淀，用电镜观察。显示组织切片或细胞内糖类、脂类、酶、核酸等化学成分。 PAS反应：(periodic acid Schiff reaction) 显示多糖和蛋白多糖的常用方法，又称过碘酸-雪夫反应。过碘酸先将糖分子的乙二醇基氧化为乙二醛基，后者继而与Schiff试剂结合，形成紫红色反应产物。 免疫组织化学术(immunohistochemistry) ? 免疫组织化学又称免疫细胞化学，是指带显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应抗原进行定性、定位、定量测定的一项新技术。它把免疫反应的特异性、组织化学的可见性巧妙地结合起来，借助显微镜(包括荧光显微镜、电子显微镜)的显像和放大作用，在细胞、亚细胞水平检测各种抗原物质(如蛋白质、多肽、酶、激素、病原体以及受体等)。免疫组化技术近年来得到迅速发展。50年代还仅限于免疫荧光技术，50年代以后逐渐发展建立起高度敏感，且更为实用的免疫酶技术。 　　免疫组织化学的全过程包括：1.抗原的提取与纯化；2.免疫动物或细胞融合，制备特异性抗体以及抗体的纯化；3.将显色剂与抗体结合形成标记抗体；4.标本的制备；5.免疫细胞化学反应以及呈色反应；6.观察结果。 常用的标记物（1）荧光色素 （2）酶 （3）胶体金 物理固定比化学固定效果好，化学固定后在脱水时影响最大，蛋白会变性，影响免疫标记 由于物体进液氮后会有气化层，影响热传递，为防止气化层形成，冷冻固定有两种方式：将液氮加压使其变为固态氮，降低介质温度；或用液态瓦斯 急速冷冻或冷冻蚀刻时，克服冷冻气化层，可以降低介质温度，或先加固定液化学固定改变结构后再冻 样品送到高压腔，瞬间加压后分子动能增加，热传递瞬间加快，热传递速度增大，只有核膜上的蛋白会发生位移，其它不会 尽量用样品将样品腔填满，但不能过满，出现overlapping，加冷冻保护剂将其余部分填满，动物可用高浓度的血清蛋白或0.15mM BSA+Sucrose。 植物由于有角质层做形态，用前固定化学固定后加入样品，也可加些甘油或蔗糖，做茎或花药都可以，更容易些。做叶片用Histensin（非侵入性抗冻剂），但不能大于30min，要小于30min内加入电镜中 做根时用蔗糖，可和置换剂互溶更方便，但冷冻保护效果没有Histensin好。 置换是可以在叶片上弄几个洞或者把冻的Histinsin搓掉，方便让置换剂进去。 活细胞离心不能超过1000rpm，否则形态会发生很大变化。 可以用抽真空法。 高压冷冻 滤纸 抽真空 细胞沉积后刮下放到EP管中 加入蔗糖溶液保存 放射自显影术：通过 活细胞对放射