基础生物化学核苷酸代谢剖析.pptVIP

11 核酸的酶促降解和核苷酸代谢 11.1 核酸的酶促降解 11.2 核苷酸的分解代谢 11.3 核苷酸的生物合成 核苷酸是DNA和RNA的前体是细胞内化学能流通领域中的载体（ATP， GTP）,是NAD、FAD和 Coenzyme A等的重要成份。在糖代谢中也有重要作用，如生成UDPG等。cAMP还是第二信使。 11.1 核酸的酶促降解 生物体内存在着多种降解核酸的酶类，称为核酸酶(nuclease) ，它在核酸降解和周转中起着重要作用。 核酸酶分类 底物：脱氧核糖核酸酶(dexyribonuclease, DNase)， DNase 、核糖核酸酶(ribonuclease, RNase) RNase 作用方式：核酸外切酶（exonuclease） 核酸内切酶（endonuclease） 水解方向：3’?5’或5’ ? 3’ 产物：3’-磷酸产物或5’-磷酸产物 特异性:能否识别作用位点或二酯键两侧的碱基 具有位点识别专一性的内切酶称限制性内切酶。 11.1.1 核酸酶 11.1.1.1 外切核酸酶 外切酶作用于核酸链的一端，逐个水解下核苷酸，是非特异性的磷酸二酯酶。为非特异性磷酸二酯酶。 如蛇毒磷酸二酯酶是从DNA或RNA的游离3?-羟基端开始，逐个水解下5?-核苷酸；牛脾磷酸二酯酶则从游离5?-羟基端开始，逐个水解下3?-核苷酸。 11.1.1.2 内切核酸酶 内切酶特异地水解多核苷酸内部各键，是特异性强的磷酸二酯酶。 如牛胰核酸酶作用于嘧啶核苷酸的磷酸二酯键，生成嘧啶核苷-3?-磷酸或末端为嘧啶核苷-3?-磷酸的寡核苷酸。 牛胰核酸酶专一作用于RNA，对DNA及其它磷酸二酯化合物不作用或作用活性很低。 牛胰RNase具有高度热稳定性。许多RNAase也都是如此。牛胰RNase(RNase Ⅰ)是最早分离纯化并结晶的第一个RNase，由124个氨基酸组成。 1957年在曲霉(Aspergillus)中分离提纯出RNaseTl，由105个氨基酸组成。专一水解鸟苷酸二酯键，产生3?-GMP或以3?-GMP为末端的寡核苷酸。类似的RNase从多种真菌中分离得到。 11.1.2 脱氧核糖核酸酶 脱氧核糖核酸酶专一水解DNA，作用方式作为内切酶，切断双链或单链，作为外切酶有5?→3?切割或3?→5?切割。 例如牛胰脱氧核糖核酸酶(DNase Ⅰ)，可切割双链和单链DNA，产物为5?-磷酸为末端的寡核苷酸；牛脾脱氧核糖核酶(DNaseⅡ)降解DNA产生3?-磷酸为末端的寡核苷酸。 未发现有碱基专一性DNase，但有序列专一性，即限制性内切酶(restriction endonuclease)。 11.1.3 限制性内切酶 1979年，W. Arber, H. Smith和D. Nathans等发现某些细菌细胞内存在一类能识别一定序列并水解外源双链DNA的内切核酸酶。 限制性内切酶是细菌中产生的具有高度专一性的DNA内切酶，能识别双链DNA分子上特定的位点，将两条链切断，形成粘性末端或平末端，又称为限制性内切酶(restriction endonuclease)或限制酶(restriction enzyme)，是DNA分子操作中必不可少的工具酶。 细菌除具有限制酶外，还具有一种对自身DNA起修饰作用的甲基化酶。一种限制酶和其相应的修饰酶对底物DNA的识别和作用的部位是相同的。修饰酶使该部位上的碱基甲基化，从而使限制酶对这种修饰过的DNA不再起作用。 在细胞中，限制酶可降解外源侵入的DNA，但不降解经修饰酶甲基化保护的自身DNA。 限制酶具有很强的专一性。它们对底物DNA有特异的识别位点(或称识别序列)。这些位点的长度一般在4~8bp范围内。通常具有回文结构(palindromic structure)。切割后形成粘性末端(cohesive end)或平齐末端(blunt end)。 环状或线状的双链DNA分子经限制酶作用后都形成线状双链DNA，每条单链的一端带有识别顺序中的几个互补碱基，这样的末端称为粘性末端。 大肠杆菌的EcoR I对DNA的识别顺序和酶作用产物的粘性末端。 限制酶的命名较为特殊。以EcoRI为例，第1个大写字母E为大肠杆菌的属名(Escherichia)的第1个字母，第2、3两个小写字母c。为它的种名(coli)的头两个字母。第4个字母用大写R，表示所用大肠杆菌的菌株。最后一个罗马字表示从该细菌中分离出来的这一类酶的编号。 限制酶是DNA的分子剪刀，是DNA体外重组技术和进行大分子DNA分析的重要工具。如EcoRI、EcoRⅡ、HindⅢ、PstI等。 限制酶的发现对基因工程研究有极大的促进作用。目前已发现数百种可用于DNA研究的限制酶、连接酶和修饰酶等多种