NY_T2729-2015李属坏死环斑病毒检测规程.docVIP

ICS 65.020 NY 中华人民共和国农业行业标准 NY/T 2729—2015 李属坏死环斑病毒检测规程 Criterion for prunus necrotic ringspot virus detection 2015-05-21 发布 2015-08-01 实施 中华人民共和国农业部发布 刖 本标准按照GB/T 1. 1—2009给出的规则起草。 本标准由农业部种植业管理司提出并归口。 本标准起草单位:农业部花卉产品质量监督检验测试中心（昆明）、云南省农业科学院花丼研究所、 国家观赏园艺工程技术研究中心、云南省花卉育种重点实验室、云南省花卉工程技术研究中心。 本标准起草人:王丽花、瞿素萍、王继华、杨秀梅、吴学尉、王其刚、张艺萍、张丽芳、苏艳、彭绿春。 李属坏死环斑病毒检测规程 1范围 本标准规定了李属坏死环斑病毒(PrwwMS 饥??，PNRSV)的双抗体夹心酶联免疫 吸附检测法(DA^ELISA)和指示植物检测法。 本标准适用于植物组织中李属坏死环斑病毒的检测。 2取样 根据样品属性，取发芽幼苗、腋芽、枝条韧皮部、果实表皮、叶片、鳞片外表皮等器官或组织，洁净水 洗净后备用。 3检测方法 3. 1双抗体夹心酶联免疫吸附测定法(DAS~ELISA) 1. 1原理 利用抗原(病毒)与其特异性抗体在离体条件下产生专一性反应的原理。即存在于样品中的病毒颗 粒首先被吸附在酶联板孔中的单克隆抗体捕捉后，再与碱性磷酸酯酶标二抗结合反应，后加入碱性磷酸 酶底物，酶将底物水解并产生有色产物。颜色的深浅与样品中病毒的含量成正比，若样品不携带病毒则 无颜色反应。 3. 1.2仪器、用具及耗材 酶标仪(配405 nm滤光片），恒温培养箱(温度可调范围0°C?40°C)，生物培养箱(具光照、温度可 调范围0°C?50°〇,电子天平（感量为0.01 g、0.000 1 g),酸度计。微量移液器（200 pL?1 000 pL， 10斗?100 pLA 5 ?10，)，酶联板，研钵或自封袋，微量移液器吸头，离心管等。 3.1.3试剂 3. 1. 3. 1所用试剂均为分析纯，水为蒸馏水。 3.1.3.2抗体和对照 PNRSV抗体、阳性对照、阴性对照或DA^ELISA检测试剂盒均来自市售。 3. 1.3.3包被缓冲液(pH 9. 6,贮藏于4°C)碳酸钠(Na2C03)1. 59 g碳酸氢钠(NaHC03)2. 93 g叠氮化钠(NaN3)0.2g加蒸馏水溶解定容至1 〇〇〇 mL。3. 1. 3. 4 洗涤缓冲液(PBST,pH 7. 4)氯化钠(NaCl)8. 0 g无水磷酸二氢钾(KH2 P04)0.2g无水磷酸氢二钠(Na2 HP04)1.15g氯化钾(KC1)〇-2g吐温_ 20(Tween-20)〇-5g加蒸馏水溶解定容至1 〇〇〇 mL。3. 1. 3. 5样品提取缓冲液(GEB,pH 7. 4,贮藏于4°C ) 脱脂奶粉2. 0 g聚乙烯吡咯烷酮(PVP，mw24_~_0)20. 0 g无水亚硫酸钠(Na2S03)1.3g叠氮化钠(NaN3)0? 2 g吐温-20 (Tween-20)20. Og溶于PBST中，定容至1 000 mL。3. 1. 3. 6酶标抗体稀释缓冲液(EC1 ,pH 7. 4,贮藏于4°C )牛血清白蛋白(BSA)2. 0 g聚乙烯吡咯烷酮(PVP，mw24_~4。。。。）20. 0 g叠氮化钠(NaN3)〇. 2g溶于PBST中,定容至1 000 mL。 3. 1. 3. 7底物缓冲液(PNP,pH 9. 8,贮藏于4°C )二乙醇胺97. 0 mL六水氯化镁(MgCl2 ? 6H20)O.lgNaN3〇-2g溶于800 mL蒸馏水中，用2 mol/L盐酸调pH至9. 8,定容至1 OOO mL。 1.3.8底物溶液(现用现配） 根据需要称取对硝基苯磷酸二钠(PNPP)溶于底物缓冲液中配制成1 mg/mL的底物溶液。 1. 3. 9终止液(3 mol/L氢氧化钠溶液） 称取120 g NaOH，溶于1 000 mL蒸馏水中。 1.4操作步骤 1.4. 1包被抗体 在酶标板孔中加入1〇〇 用包被缓冲液按工作浓度稀释好的抗体，将酶标板用保鲜膜包好放人湿 盒中，置于4°C冰箱内孵育过夜或室温(20°C?25°C)下孵育4 h。 1. 4. 2试样制备 将待测试样和GEB按1 : 10(g/mL)的比例放人研钵或〇. 2 mm的加厚自封小塑料袋中磨碎至 匀浆，后转人离心管800 r/min?1 000r/min离心2 min,获得上清液。阳性对照、阴性对照的上