Brandford法检测蛋白浓度.docVIP

Brandford法检测蛋白浓度 灵敏度：25 ug/ml-200 ug/ml 原理：考马斯亮蓝G250有红、蓝两种不同颜色的开工，在一定浓度的乙醇及酸性条件下，可配成淡红色的溶液，当与蛋白质结合后，产生蓝色化合物，反应迅速而稳定，反应化合物在465－495nm处有最大的光吸引值，化合物颜色的深浅与蛋白浓度的高低成正比关系。 溶液： Brandford储存液 100 ml 95%乙醇，200 ml88%磷酸，350 mg Serod G蓝，室温下长期保持稳定 Brandford工作液 425 ml双蒸水，15 ml 95%乙醇，30 ml　88%磷酸，30 ml Brandford储存液 3) BSA标准溶液 1 mg/ml BSA标准溶液 用滤纸过滤，保存于室温棕色瓶中，可使用数周，但在使用前需要再过滤。 步骤： 做标准曲线所用的已知蛋白质应和未知浓度蛋白质溶液一起准备。每一样品应当做两到三次重复。 由于蛋白质和染料形成复合物的反应是连续进行的。Brandford工作液应当按照颜色反应的次序依次测定。每一次测定未知蛋白质溶液的浓度时都应当作一条新的标准曲线。 要用所测值的平均值作出标准曲线 反应2 min后进行测定 Bradford法所测定的标准曲线在2.5ug－15ug BSA的浓度范围内保持线性关系。 　　 样品号 BSA体积(ul) BSA量(ug) 实验缓冲液 Brandford试剂 A595 1 0 0 20 0.2 0.000 2 0.5 0.5 19.5 0.2 0.120 3 0.5 0.5 19.5 0.2 0.130 4 1 1 19 0.2 0.250 5 1 1 19 0.2 0.215 6 1.5 1.5 18.5 0.2 0.331 7 1.5 1.5 18.5 0.2 0.364 8 2 2 18 0.2 0.364 9 2 2 18 0.2 0.460 10 2.5 2.5 17.5 0.2 0.531 11 2.5 2.5 17.5 0.2 0.562 12 3 3 17 0.2 0.633 13 3 3 17 0.2 0.617 5)按以下步骤确定蛋白质浓度 a 计算样品的平均光吸收值 b 使用标准曲线，计算出标准曲线相交所对应的蛋白量的值(注意，每孔的值要减去空白对照的值) c 根据各自的体积计算样品的浓度 d 低于标准曲线线性范围的平均值应当忽略不计 注意事项： 在反应5min后充分显色。但在10 min之内测完标准品和样品，则颜色损失误差将会小于2%