基因定位与克隆教材.pptVIP

寻找基因的思路： 二、体细胞杂交法 体细胞杂交法 也称细胞融合(cell infusion)，是将来源不同的两种细胞融合成一个新细胞。新产生的细胞称杂种细胞(hybrid cell)，含双亲不同的染色体。 原理 细胞进行融合时，培养液中只有部分细胞融合成杂种细胞，还有大量未融合的双亲细胞。这就需要选择分离纯化杂种细胞。为此要创造一种只让杂种细胞生长繁殖而亲本细胞死亡的环境。这就要利用杂种细胞和亲本细胞对生长条件的要求和代谢的差异来进行选择。其中最常用的是HAT选择系统。 HAT选择系统： 人的细胞株：缺乏HGPRT酶 小鼠细胞株：缺乏TK酶 HAT培养基： H 为次黄嘌呤，是HGPRT的底物，为DNA合成提供原料 A 可阻断正常的DNA合成（嘌呤及TMP合成受抑制） T 在胸苷激酶（TK）的作用下生成胸腺嘧啶核苷酸，为DNA合成提供原料 将筛选出来的杂种细胞转移到正常培养基继续培养，由于人和鼠都有各自不同的生化和免疫学特性，Miller等运用体细胞杂交并结合杂种细胞的特征，证明杂种细胞的存活需要胸苷激酶（TK）。凡是含有人17号染色体的杂种细胞都因有TK活性而存活，反之则死亡，从而推断TK基因定位于17号染色体上。 三、克隆嵌板法 克隆嵌板法(clone panel method) 根据不同杂种细胞保留或丢失的人染色体有时是重叠的情况，设计的一种简便而实用的基因定位方法。 3）原位杂交的步骤 制备中期染色体 DNA原位变性 变性 放射性或非放射性标记探针 杂交（在载玻片上） 洗膜 放射性标记：放射自显影 检测 非放射性标记：荧光染料与抗体或蛋白结合 记录杂交信号 结合染色体形态进行基因定位 2、荧光原位杂交（florescence in situ hybridization，FISH） 用特殊荧光素标记探针，变性成单链后与变性后的染色体或细胞核靶DNA杂交。在荧光显微镜下观察并记录结果。 单色FISH 基因的克隆是利用体外重组技术，将特定的基因和其它DNA顺序插入到载体分子中。 基因克隆的主要目标是识别、分离特异基因并获得基因的完整的全序列，确定染色体定位，阐明基因的生化功能，明确其对特定性状的遗传控制关系。 定位克隆 又称为“逆向遗传学”，始于20世纪80年代后期 利用遗传连锁或细胞学定位技术将基因定位于染色体的特定区带。 定位：通过连锁分析找出与目的基因紧密连锁的遗传标记在染色体上的位置。 克隆：从定位的染色体区段内分离克隆所要的基因，并进一步研究其功能。 定位候选克隆 该方法是定位克隆的进一步发展 将相关基因定位于染色体相关区域 该染色体区域得到若干候选基因 进一步分析得到目的cDNA 蛋白质功能研究 cDNA筛选　染色体定位只是定位克隆的第一步。由于cDNA筛选、确认的困难 ，使其成为定位克隆策略的“瓶颈”。目前获得基因序列的方法大致有: (1) 对 500kb的关键部位进行直接测序； (2) 比较基因组作图和测序； (3) 基因结构特征分析； (4) cDNA捕获：CpG岛捕捉层析 法、外显子捕捉法、 直接筛选PCR法等方法 功能克隆 收集所要克隆的基因的蛋白质产物及其功能的信息，用以分离基因，并对基因进行定位。 6. 怎样确定基因位置 两点测验：确定目标基因与一个标记的遗传距离 三点测验：确定目标基因与二个标记的位置关系及相互之间的遗传距离。在由隐性单株组成群体中,若二个标记发生交换的单株绝大部分是不同的，表明目标基因位于这二个标记之间 作图软件：利用Mapmaker软件确定目标基因与多个标记(含2个)的位置关系及相互之间的遗传距离 性状与标记的关系：从某种角度上讲，一个性状可看作为一个标记，一个标记也可看作为一个性状 精细定位 (fine mapping)： 在基因定位中，找到已定位的分子标记，只是完成了基因的粗定位，即只知道基因的大概位置，这对于基因定位来说是不完善的。基因精细定位，就是在基因粗定位的基础上，进一步完善基因定位的工作。基因精细定位的目标，对于不同的目的有不同的要求。 精细定位是基因图位克隆的