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(三)、细胞、原生质体融合 体细胞融合是指两个不同种类的细胞，加上融合剂，在一定条件下，彼此融合成杂交细胞，使来自两个亲本细胞的基因有可能都被表达，这就打破了远缘生物不能杂交的屏障，提供了创造新物种的可能。 动物细胞不具有细胞壁，细胞融合技术较植物成熟和成功，但局限于获得杂种细胞及其无性细胞系。　 用杂种细胞核代替维尔·穆特获得克隆羊所采用的乳腺细胞核可以获得物种间杂种生物个体。如今已在动物间实现了小鼠和田鼠，小鼠和小鸡，甚至于小鼠和人等许多远缘和超远缘的体细胞杂交。 人与小鼠杂种细胞的无性细胞系曾在人类基因染色体定位研究上发挥重要的作用。 植物细胞融合由于细胞壁的存在而受到极大的限制。因此，去除细胞壁分离原生质体的技术是植物细胞杂交的基础。获得杂种细胞及其再生植株后，即可进行物种间细胞核、染色体以及细胞器的转移。植物间的体细胞融合所得到的杂交细胞，已达到了完整的植株水平，获得了新的杂交植物，如 “西红柿马铃薯”、“拟南芥油菜”和“蘑菇白菜”等。 （四）细胞核移植 细胞核移植对动物优良杂交种的无性繁殖具有重大意义。1981年瑞士学者伊梅恩斯等用灰鼠的细胞核注入到除去了精核和卵核的黑鼠的受精卵内，然后再将这个由黑鼠细胞质和灰鼠细胞核组成的卵体外培养形成胚胎后再移植到白色雌鼠的子宫里，发育后的仔鼠是灰色的。说明仔鼠的性状取决于细胞核的来源。这一技术的成功与完善对于优良家禽的无性繁殖和濒临绝迹的珍贵动物的传种意义重大。 （五）细胞器移植 　 　　细胞器的移植主要是指叶绿体和线粒体的移植。如卡尔森用白化型原生质体摄取正常的叶绿体，进而发育成正常的绿色植物；或有人用抗药型草履虫的线粒体植敏感的草履虫细胞，使后者获得抗药性等。 1.教学目的和要求 （1）掌握基因工程的基本原理 （2）学习基因工程的基本内容和技术 （3）掌握内切酶、连接酶的功能 2.教学重点 （1）掌握基因工程的基本原理和技术 （2）学习目的DNA的分离 第十三章基因工程 第十三章基因工程（Gene Engineering） 在各种酶的作用下，将目的基因的DNA分子与载体DNA分子相连接，形成重组的DNA分子，以一定的方式导入原无该类分子的宿主细胞，并使宿主生物变为自然界原来没有并能连续传代的新生物。 要点： 供体、载体、受体 基因工程分狭义（上游）：重组、克隆、表达的设计和构建。 广义（下游）：表达工程菌的发酵培养和产物的纯化。 目的：DNA扩增，外源基因表达产物，表达调控，改造生物遗传特性等。 基因工程 限制性内切酶和载体是基因工程的众多理论与技术基础中最重要的基石。 基因工程的基本步骤可概括为： 目的基因的获得(基因克隆)； 目的基因与载体连接(DNA分子重组)； 重组DNA分子导入受体； 转化子的筛选、鉴定。 限制性内切酶与DNA连接酶 细菌细胞内特异性降解外源(异源)核酸分子的核酸酶。其作用： 特异性降解异源DNA分子(甲基化修饰差异)； I类限制酶随机切割双链DNA分子，II类限制酶识别、切割特殊的回文(对称)序列； II类限制酶交错切割DNA双链，产生粘性单链末端。 来源不同、具有相同粘性末端DNA片段在DNA连接酶的作用下可准确连接成重组DNA分子。 通常使用来自T4噬菌体DNA连接酶。 重组DNA技术是基因工程最核心的技术。 载体(vector) 用于承载、克隆、转移目的基因(DNA片段)，能自我复制的DNA分子。 在基因克隆时：将目的片段转移到宿主细胞中进行复制克隆——克隆载体； 在基因导入受体时：将目的片段转移到受体细胞中并进行使之表达——转化载体或表达载体。 常用基因工程载体有： 细菌质粒(克隆)； λ噬菌体(克隆)； 柯斯质粒(克隆)； 穿梭质粒(克隆/表达)； 细菌人工染色体(克隆/表达)； 酵母人工染色体(克隆/表达)； Ti质粒及其衍生载体(转化)。 (一)、目的基因的获得 基因工程最主要的特点是其定向性，也就是对特定的基因进行操作。因此分离目的基因并获得足够的拷贝数(基因克隆)是基因工程及相关研究工作的前提。 1. 基因库构建与目的基因分离； 2. PCR扩增、克隆基因； 3. 基因合成(化学法、酶促法)。 获得目的基因后可进行的研究还包括：序列分析、结构分析、表达机制以及表达机制研究。 克隆的含义 名词(pl. clones)：克隆、无性(繁殖)系。 生物个体、细胞的无性繁殖系； 同一基因或DNA片段的多份拷贝。 动词(cloning)：克隆。 细胞克隆：从单个细胞产生一组具有同样遗传组成的细胞； 分子克隆：获得单个基因/DNA片段多份拷贝。常用的方法有①将带有目的片段的重组DNA分子导入到特定宿主细胞中，利用宿主细胞DNA复制系统进行复制；②利用DNA聚合酶在无细胞系统中复制(PCR, 聚合酶链式反应)。 基