离子交换层析剖析.ppt

实践中采用何种形式梯度洗脱液较为理想，这完全取决于特定的应用要求，并无规律可循。一般最好从线性梯度开始，然后按照摸索试验进行。 在阶梯式梯度溶液中所用的适宜浓度，应在线形梯度溶液的基础上慎重地选定。 在一定时间内，不同形式的梯度液流经层析柱某点累积体积时的浓度C，可用公式计算： C=CB-（CB-CA）(1- ) CB：B瓶浓度 CA：A瓶浓度 V2：流经层析柱体积 V1：洗脱液的总体积 V1 V2 举例： 离子交换层析中，以0.1-0.5mol/L的NaCl梯度的缓冲液洗脱（总体积200ml，梯度瓶直径相同），通过层析柱75ml时， NaCl浓度是多少？ 0.5-(0.5-0.1)×(1- ) =0.25mol/L 75 200 7、洗脱速度 洗脱速度通常要保持恒定 洗脱速度慢比快的分辨率好 如果洗脱峰相对集中某个区域造成重叠，则应适当缩小梯度范围或降低洗脱速度来提高分辨率；如果分辨率较好，但洗脱峰过宽，则可适当提高洗脱速度。 8、洗脱液的监测收集及组分鉴定 监测 用紫外检测仪进行，在280nm处观察洗脱液的光吸收 收集 用分布收集器收集，可以自动收集，也可以手动收集 鉴定 聚丙烯酰胺凝胶电泳、测定活性等 9、离子交换剂的清洗、再生和保存 可溶于碱的污染物 0.1 mol/L NaOH洗涤、蒸馏水洗涤、结合缓冲液洗涤，可以除去诸如脂类、蛋白质和核酸这类的污染物。 对于疏水性污染物 乙醇溶液（如70%的乙醇）或非离子型的去污剂洗涤，可以除去脂类和其他的疏水性物质。 → → 金属污染物 EDTA饱和的10 mmol/L HCl（即pH=2）处理柱子 沉淀物杂质 去污剂、尿素和盐酸胍，可将柱子在6 mol/L 的尿素中平衡和温育，然后用去离子水和缓冲液洗涤。 再生 对使用过的离子交换剂进行处理，使其恢复原来性状的过程。 酸碱交替浸泡 保存 处理洗净蛋白等杂质后，加入适当的防腐剂，一般加入0.02 %的叠氮钠，4°C下保存。 第四节 应用 鸡卵类粘蛋白的纯化DEAE-纤维素柱层析纯化  （1）DEAE-纤维素的处理：称取10g DEAE-纤维素粉，置于250 mL烧杯中，加入150 mL 0.5mol/L NaOH-0.5mol/L NaCl溶液浸泡20 min。然后用布氏漏斗抽滤，蒸馏水洗至pH 8.0左右，抽干。再移至250 mL烧杯中，加入150 mL HCL溶液浸泡20 min，转移到布氏漏斗中，抽滤，用蒸馏水洗至pH6.0左右，最后转移到烧杯中，用150 mL 0.02 mol/L pH6.5磷酸盐缓冲液浸泡15min，经真空干燥器脱气后装柱。 （2）装柱：选用15×200mm层析柱，垂直夹与铁架台上。将脱气后的DEAE-纤维素装入柱内。关闭层析柱出水口，然后在搅拌下将浆状的离子交换剂缓缓地倾入柱中，使之自然沉降，打开柱出水口，调节合适流速，使凝胶继续沉集。待沉集的胶面上升之距柱上口3～5 cm时关闭层析柱出水口。用pH6.5磷酸盐缓冲液平衡，流出液在核酸蛋白质检测仪上绘出稳定的基线即可加样。 （3）交换吸附：将经Sephadex G-25脱盐后的卵类黏蛋白粗提液上样吸附，调节流速15d/min，待样品全部流入柱床后，再用pH6.5磷酸盐缓冲液平衡，目的是洗去未被吸附的杂质蛋白，直至基线稳定。 （4）洗脱：改用含0.3mol/L NaCl的pH6.5磷酸盐缓冲液洗脱，收集蛋白峰。如果在前面的提取过程中条件控制的适宜，提取的鸡卵类黏蛋白是较纯的，洗脱时可能不出现鸡卵清蛋白峰（第I峰）。 思考题 1、离子交换剂有哪几部分组成？何为阳离子和阴离子交换剂？ 2、影响离子交换剂膨胀度的因子有哪些？哪个是关键因子？为什么？ 3、如何选择离子交换剂？ 4、梯度溶液的变化速率、交换剂的膨胀度、装柱的均匀度，对样品的分辨率有何影响？ 5、离子交换层析中，以0.1-0.5mol/L的NaCl梯度的缓冲液洗脱（总体积200mL，梯度瓶直径相同），通过层析柱75mL时， NaCl浓度是多少？ 6、现有肌苷样品溶液100mL，浓度为2mol/L，若每克干树脂总交换容量为3.5mmol，而实际交换容量是总交换容量的5%，问大约需要多少树脂？ 季胺乙基ＱＡＥ * 2、交换容量测定 离子交换剂的总交换容量通常以每毫克或每毫升交换剂含有可解离基团的摩尔数（mol?/?mg或mol?/?ml）来表示。通常可以由滴定法测定。 阳离子交换剂首先用HCl处理，使其平衡离子为H+。再用水洗至中性，对于强酸型离子交换剂，用NaCl充分置换出H+，再用标准浓度的NaOH滴定生成的HCl，就可以计算出离子交换剂的交换容量。 （五）稳定性 离子交换剂都具有很好的理化稳定性