功能基因组学讲述.ppt

质谱技术的基本原理： 样品分子离子化后，根据不同离子间质核比（m/z）的差异来分离并确定分子量。 质谱仪组成： 进样装置、离子化源、质量分析器、离子检测器和数据分析系统组成。 质谱技术在蛋白组研究中的应用： A 肽质谱和肽序列分析 蛋白质经双向电泳后，分离到的蛋白质被切割下来，进行胶内酶解，或转移到PVDF膜上，进行膜上膜解，然后上样进行测序。 但目前质谱法还不能够取代Edman降解法测序，可是其测定速度较快。 B 鉴定翻译后修饰的蛋白质 质谱可通过特征离子监测的方法很快确定磷酸化肽，通过串联质谱确定磷酸化位点； 质谱可与蛋白酶解和糖苷酶酶解结合，寻找糖肽，鉴定糖基化位点； 质谱还参与糖链组成、结构甚至分支情况等的分析。 C 质谱技术的其他作用 质谱可对蛋白质二硫键进行定量和定位，分析蛋白质与蛋白质的相互作用，蛋白质与其他分子的相互作用，以及蛋白质的二级结构等。 差异显示 差异显示逆转录PCR法（DDRT-PCR) RNA指纹法 RNA Fingerprinting 基因组表达及调控的研究 在全细胞的水平，识别所有基因组表达产物： mRNA： c DNA 阵列 蛋白质：二维电泳 、质谱 研究生物大分子相互作用： 阐明基因组表达在发育过程中的时空整体调控网络。 蛋白质组学： 高通量解析蛋白质的高级结构，是连接基因组功能研究和新药开发的桥梁。 基因芯片技术及应用 基因微阵列技术 将大量基因探针分子(点阵密度400/ cm2)固定于载体(玻片或薄膜后)与标记的样品分子(mRNA、cDNA、基因组DNA)进行杂交 检测每个探针分子的杂交信号强度，获取样品分子数量和序列信息 优点：可以一次性对大量样品序列进行检测和分析，从而解决了传统核酸印迹杂交(southern blotting和northern blotting等)技术操作繁杂、自动化程度低、操作序列数量少、检测效率低等问题. 基因表达测定 寻找基因突变体 多态性分析 DNA测序 基因组文库作图 疾病诊断和预测 药物筛选 基因芯片的应用 使用DNA芯片进行基因表达模式研究，当今功能基因组学中一个非常热门的课题 DNA芯片技术跟踪mRNA转录过程, 转录本组系。研究mRNA序列, 可以估计蛋白质翻译率 斯坦福大学Affymetrix和Patrick Brown的DNA芯片利用cDNA与mRNA互补的性质跟踪了活细胞中mRNA的定量转化.? 基因芯片 基因芯片示意 人类基因组芯片(Genetic Files) 美国前总统克林顿在1998年10月对全国的演讲中指出：“未来十二年，基因芯片将为我们一生中的疾病预防指点迷津” 基因芯片的应用 生物信息学的工具 基因相关性研究 基因功能 药物设计和开发 潜在反义试剂开发 个体化医疗 身份识别 基因诊断 其他与生物有关的领域 特定基因检测 突变检测 多态性分析 基因表达谱 方法 EST法 芯片 / 微阵列法 SAGE法 通量 较低 可高可低 高 操作 简便性 简单易操作，但需大规模测序支持 技术难度高，需专门点样、扫描等硬件设备支持 技术难度高，需大规模测序支持 可定量性 不可定量 可定量 可定量 灵敏度 精确度 较低 较高 高 检测基因是否已知 已知、未知均有，可用于发现新基因 通常为 检测已知基因 已知、未知均有，可用于发现新基因 相关技术的比较 简述原核生物与真核生物基因表达调控的主要区别。 * Digest the double stranded cDNA with a sequence-specific restriction enzyme (an anchoring enzyme) that cleaves most transcripts at least once. Nla III is used as an anchoring enzyme since Nla III sites are known to occur approximately every 250 bp. 5. Cleave with Mme I, a Type IIS restriction enzyme (tagging enzyme). Mme I binds to a recognition sequence in the adapter adjacent to the CATG site and cleaves the cDNA ～21 bp downstream from the adapter, releasing a ~60-bp tag with a 2-bp